液體活檢在肺癌精準醫療中的應用

作者：張夢穎 李敏 胡成平

來源：中華醫學雜誌2016年11月15日第96卷第42期3430-3433頁

肺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，病死率高。目前研究、分析腫瘤基因所用的標本多來自於肺組織穿刺活檢或是手術。然而這些方法都是有創的，且不能多次獲得標本以追蹤病情以及腫瘤基因狀態的變化。近年來一項新的檢測技術——液體活檢問世，為肺癌的精準診斷和個體化治療帶來了新的希望。液體活檢通過檢測體液（主要為外周血，其次還有唾液、尿液、胸腹腔積液等）葉的循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤核酸[包括循環腫瘤DNA（clDHA）循環腫瘤RNA(ctRNA)]、外泌體等腫瘤米源的牛物標誌物這種相對無創的方式，動態反饋肺癌的進展，為肺癌的早期診斷、病情評估、療效跟蹤、預後預測等提供了一種簡便快捷的手段。現簡要介紹如下。

1一、基於CTC的液體活檢

1．CTC的定義：CTC是指由於細胞脫落、手術操作等內外部因素導致的從原始腫塊或轉移灶上掉落至外周血循環中的腫瘤細胞。血液是重要的轉移途徑，在血液中檢測到的CTC有著重要的意義。此外，CTC還為我們提供了一個從細胞層面或者亞細胞層面分析腫瘤細胞的機會，包括對腫瘤細胞的形態學觀察、異質性研究及DNA、RNA、蛋白質分析，甚至可體外培養用於腫瘤耐藥性研究。

2．CTC計數在肺癌精準醫療中的應用：CTC計數對肺癌的早期診斷、療效及預後評估都有重要意義。Ilie等對168例無肺癌臨床癥狀、肺癌血清標誌物無異常、肺部CT未發現結節的慢性阻塞性肺疾病患者的外周血進行了CTC檢測，5例(3%)發現了惡性的CTC。而這5例患者在平均3.2年的時間內，肺部CT上都發現了結節；手術後病理顯示4例為腺癌，1例為鱗癌，腫瘤平均直徑為1.7 cm，分期均為IA期。5例患者接受手術後不需後續治療。這說明CTC對肺癌早期診斷和篩查有重要意義。Dorsey等對23例放療前的非小細胞肺癌( NSCLC)患者進行了外周血CTC檢測，15例(65%)發現了CTC，平均值為62.7個/ml。在放療過程中這些患者外周血CTC的平均值降至9.4個/ml，而放療後則降至0.6個/ml。有1例患者在放療後血液中CTC值不降反升，由198.5個/ml升至545.0個/ml，該患者在放療後出現了轉移。這說明外周血CTC值對評估肺癌療效有一定幫助。Hou等以50個/7.5 ml為界，將小細胞肺癌( SCLC)患者分為「有利的」（CTC< 50個/7.5="" ml）和「無利的」（ctc="">50個/7.5 ml）兩組，隨訪結果顯示有利患者的總生存期( Os)要長於無利患者(11.5比5.4個月，P<0.>

3．CTC體外培養及基因分析在肺癌精準醫療中的應用：CTC進行體外培養所得的標本，可較好地評估腫瘤對治療的反應。HodgkiIisen等證實，從未經過化療的進展期SCLC患者外周血巾獲得的CTC町在免疫缺陷小鼠體內產生腫瘤，即CTC移植瘤(CDX)。研究者們對4組CDX標本及與之對應的臨床所得標本進行了病理學和免疫組織化學分析，均發現了典型的SCLC形態學特點，且小鼠體內的CDX可以真實地顯示提供CTC患者的腫瘤對順鉑和足葉乙甙治療的反應。說明CT(、的體外培養可作為一種分析腫瘤特性的手段。同時，CTC的基因分析也有重要意義。Maheswaran等通過對12例表皮牛長因子受體( EGFR)墓因突變型肺癌患者CTC基因分析，發現其中11例患者CTC有EGFR基因突變，並且通過對CTC的基因分析可發現T790M耐藥性突變，提示CTC有望作為一種對腫瘤基因實時的動態檢測手段應用於臨床。

此外，CTC的單細胞測序也在飛速發展。Ni等對7例肺腺癌患者（其中1例合併了腺癌及SCLC，還有1例由腺癌表型轉化為SCLC）和4例SCLC患者的單個CTC進行了全基因組測序，發現一些重要基因的突變如EGFR基因、磷脂醯肌醇一3 -激酶(PIK3CA)基因及腫瘤蛋白、視網膜母細胞瘤基因1基因都可在CTC中測得。

2基於ctDNA的液體活檢

1．ctDNA的定義：壞死或凋亡的細胞會釋放DNA到血液中，這些DNA可以從血漿中分離出來，被稱為循環遊離DNA( cfDNA)，而在腫瘤患者的血液中，一部分cfDNA來自死亡的腫瘤細胞，這部分DNA就被定義為ctDNA。

2．ctDNA檢測在肺癌精準醫療中的應用：ctDNA為EGFR基因突變檢測提供了一個簡便的新方法，也可作為ECFRT790M突變的監測手段。Mok等對238例肺癌患者的組織標本及血液標本進行配對，並檢測其EGFR基因突變情況，發現與組織標本相比，血液標本檢測的敏感度和特異度分別為75%和96%，說明血液標本與組織標本具有較高的一致性；他們還以血漿ctDNA EGJFR突變狀態為分類標準，將患者分為突變陽性組和陰性組，兩組患者均進行厄洛替尼以及安慰劑治療，分別計算各組無進展生存期( PFS)和Os，可得到與以組織標本分類相似的結果，說明血液標本與臨床治療相關性好；此外，他們還發現，第3個化療周期後血液標本未測得EGFR突變者預後要好於測得EGFR突變者。這說明血液標本的動態變化可作為一個可靠的指標，用於臨床監測治療的療效，並預測疾病的發展。Zheng等12]對318例NSCLC患者進行研究，發現117例患者獲得了酪氨酸激酶抑製劑( TKI)耐藥性，其中55例可在ctDNA中測得ECFR 20號外顯子第90位密碼子錯義突變（T790M突變）。隨訪後發現近一半的ctDNA T790M突變陽性患者提前約2.2個月達到疾病進展，且在接受TKI治療後，ctDNA T790M突變陽性組的中位Os為26.9個月，而ctDNA T790M突變陰性患者至研究結束大部分仍存活(P=O. 048 9)。這項研究證實了血漿樣本可作為接受TKI治療患者的療效監測手段，且血漿ctDNA T790M突變陽性可作為預後差的標誌。

歐洲藥品管理局2014年9月批准當難以獲得腫瘤組織樣本時，可採用外周血ctDNA作為補充標準評估EGFR基因突變狀態；2015年2月，中國國家食品藥品監督管理總局( CFDA)已批准吉非替尼說明書更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應進行EGFR突變檢測的基礎上，如果腫瘤標本不可評估，則可使用從血液（血漿）標本中獲得的ctDNA進行評估。另外，我國NSCLC血液EGFR基因突變檢測巾國專家共識指出：當腫瘤組織難以獲取時，血液是EGFR基因突變檢測合適的替代生物材料，也足對可疑組織檢測結果的補充。

近年來基於ctDNA的二代測序(NGS)技術也逐漸成熟。NGS可同時對數百萬條DNA模版進行測序，大大提高了測序效率，降低測序成本。Newman等提出了一種改良的N(;S測序法，稱之為癌症深度測序個體化分析(CAPP-Seq)。他們認為CAPP-Seq的檢測效能並不低於腫瘤活檢，並能準確測定肺癌的基因型。Xu等利用NGS平台，對42例進展期NSCLC患者的腫瘤DNA及ctDNA進行對比，發現E(;FR、鼠類肉瘤病毒癌基因、PIK3CA和腫瘤蛋白這幾種肺癌驅動基因在腫瘤DNA及ctDNA中的相似性達76%,。說明二代測序技術在ctDNA測序中的應用口，使ctDNA更大地發揮其價值。

1．ctRNA的定義：循環腫瘤核酸除ctDNA外，還有ctRNA。腫瘤相關RNA可由多種途徑釋放入血，而血小板可螯合這部分RNA產生基於腫瘤血小板(TEPs)」。此外循環非編碼RNA( ncRNA)，如微／J、RNA( miRNA)、長鏈ncRNA也是ctRNA的一部分。

2．血小板RNA檢測在肺癌精準醫療中的應用：間變性淋巴瘤激酶( ALK)基因重排的NSCLC對ALK-TKIs抑製劑克唑替尼具有很高的敏感性，而血小板是一個很好的檢測ALK基因重排的介質。Nilsson等。對29例具有棘皮動物微管結合蛋白樣4( EML4)-ALK基因重排並且使用克唑替尼進行治療的NSCLC患者進行研究，結果顯示用血小板檢測EM14-ALK基因重排的敏感度和特異度分別為65%和100%。此外，在這29例患者中，從血小板中發現EML4-

ALK重排的患者PFS為3.7個月，而未發現EM~-ALK重排的患者PFS為16個月(P=0.02)。這說明血小板有望成為一種相對無創的檢測EML4-ALK基因重排的手段，並可有效地監控和預測克唑替尼的療效。

3．循環ncRNA檢測在肺癌精準醫療中的應用：肺癌患者外周血中ncRNA的表達量及表達水平都與健康對照有所差別。Chen等19對NSCLC患者血清miRNA進行表達譜分析，發現與健康對照組相比，NSCLC患者血清中缺失的miRNA有28種，而有63種新出現的miRNA。這種差異可用來區分患病個體與健康個體。Weber等發現NSCLC患者外周血中長鏈ncRNA人肺腺癌轉移相關轉錄本1( MALATI)的表達水平與健康對照不同，用MALATI區分NSCLC患者與健康個體的敏感度為56%，特異度為96%；提示長鏈ncRNA有望成為肺癌的新型生物標誌物。

1．外泌體的定義：外泌體是指生理或病理狀態下的細胞釋放的具有脂質雙層膜結構的小囊泡，直徑40 - 100 nm，內含大量細胞來源的分子如RNA、DNA和蛋白質等。腫瘤細胞口J通過釋放外泌體與腫瘤微環境中的其他細胞相互作用；而外泌體在腫瘤的進展，轉移血管生成，免疫逃避等過程巾都發揮著重要作用。由於外泌體內含大量生物信息分子，且被脂質雙層膜結構包裹，相對穩定，所以分離外泌體並對其內含物進行分析相對簡單。研究發現，雖然生理和病理狀態下的許多種細胞都可釋放外泌體，但各種類型的細胞釋放的外泌體巾有一些共同蛋白質分子，如CD63、CD81、CD9、腫瘤易感基因-101蛋白、凋亡基因一2受體相互作用蛋白及熱休克蛋白70，因此可以這些蛋白質為標誌識別外泌體。

2．外泌體檢測在肺癌精準醫療中的應用：肺癌細胞釋放的外泌體miRNA與正常肺組織釋放的外泌體miRNA有很大不同，所以外泌體有潛力成為血液中生物標誌物。M unagala等在對小鼠模型研究中發現，複發肺癌小鼠腫瘤細胞中miRNA-21和miRNA-155水平相較於原發肺癌患者明顯上調，這兩種miRNA在複發肺癌小鼠外泌體中含量也有所增加。此外，複發肺癌小鼠腫瘤細胞中多種疾病標誌物表達增加，同時外泌體中這些蛋白表達也增加。這提示外泌體可作為一種血液標誌物反應腫瘤細胞狀態。

5基於分泌蛋白質組的液體活檢

1．分泌蛋白質組的定義：分泌蛋白質組是指活細胞所分泌的大量的、複雜的蛋白質分子，廣義上的分泌蛋白質組還包括活細胞表面掉落的蛋白質分子。這些蛋白質在細胞間的信號傳導、細胞間交流以及細胞的遷徙中都發揮著重要的作用。

2．分泌蛋白質組檢測在肺癌精準醫療中的應用：相比於細胞蛋白質組，分泌蛋白質組的優勢在於其在血液中可測，因此分泌蛋白質組可作為血液中的腫瘤標誌物。另外，分泌蛋白質組還可為研究腫瘤微環境、細胞間的相互作用及腫瘤轉移和侵襲的機制提供重要的平台。目前肺癌巾應用的分泌蛋白質組來源的血液生物標誌物有：癌胚抗原、絀胞角蛋白19片段、組織多肽抗原、胃泌素釋放前體肽、神經特異性烯醇及腫瘤M2型丙酮酸激酶。

6基於腫瘤相關循環微粒( taMPs)的液體活檢

1．taMPs的定義：微粒指在細胞活化過程中或細胞凋亡早期由細胞內向細胞外排放的細胞膜包裹的微粒，其直徑在100 -1 000 nm，微粒與外泌體最大的不同之處在於微粒含有其所來源的細胞的表面標誌物而外泌體不含有。微粒可從全血、血漿、血清中被分離出來，taMPs則足由腫瘤細胞排放至血液中的微粒。

2．taMPs檢測在肺癌精準醫療中的應用：Willms等提出taMPs可作為新的腫瘤血液標誌物。他們對52例結腸癌患者，40例NSCLC患者及11例胰腺癌患者進行研究，以55名健康個體及43例結節性甲狀腺腫患者作為陰性對照，發現腫瘤患者外周循環中EpCAM+及EpCAM+ CD147+的taMPs顯著升高，而惡性腫瘤患者外周循環中的EpCAM+CD147+又明顯高於結節性甲狀腺腫患者，且EpCAM+CD147+含量與結腸癌腫塊的大小有很強的相關性。他們認為，EpCAM+ CD147+雙陽性的taMPs可作為新的，用與篩查、診斷腫瘤以及監測腫瘤療效的參數。

液體活檢是一種相對無創的活檢技術，具有操作簡單，標本易獲得，重複性強等優勢。近年來液體活檢的檢測技術在飛速發展。如上文所述，液體活檢的方法也越來越多樣化，但不同檢測方法其側重的方面也有不同之處（表1）。

CTC檢測為我們提供了從細胞層面或者亞細胞層面分析腫瘤細胞的機會；ctDNA易獲得，在血漿中的含量高於CTC，是一種更加簡潔分析腫瘤DNA的方法；ctRNA能反應DNA層面所不易檢測的基因突變狀態，如缺失與重排等；外泌體、分泌蛋白質組及taMPs中，都含有腫瘤源性的生物信息分子，對不同部位來源、不同發展階段的肺癌細胞信息有潛在的提示作用。這些不同的液體活檢方法各具所長，其發展應是相輔相成的，而非競爭替代。綜上，液體活檢技術的應用有助於肺癌的早期發現、實時評估，以及準確預測預後，並且為其的療效提供一個動態的反饋。