我的研究結果撞了前人的工作？實驗狗的我默默走了個液相
最近，我們組一篇關於雙黃連作用於MCU的文章，引起了一些爭論，這沒什麼，我的態度也很明確，首先，我們課題組水平有限，我也從沒說過老子天下第一就不許提意見。第二，提意見要提到點子上，不能自己都沒看懂就開始瞎挑毛病，或者預設立場，得出不該得出的結論，那就不是討論問題的態度了。
比如，就有人寫一篇文章說這個研究跟之前的研究結果打架：
幾用來包：再信中醫文章我就是狗
首先要說明，很感謝這位老兄 @幾用來包 能仔細看文獻，畢竟在中醫板塊，首先有心情讀文獻的人就不多，能讀懂的人就更少，他的很多結論和觀點，也都是認真讀過之後得出的，對此我表示讚賞，然而他的這篇文章的核心觀點，我實在是不敢苟同。
他說我們組的研究結果撞了前人的研究，然而我們卻採取視而不見的態度，或者是檢索文獻的能力出了問題。然而果真如此嗎？
一點點來看吧。
首先 @醫師黃繼斌 在科普我們組這篇研究的文章中講過，對於中藥混合物體系的藥效確認之後，沿襲青蒿素髮現的思路，尋找有效組分，是一條光明的道路，然而這個工作卻沒有能夠進行下去。只是這位老兄覺得在初步圈定活性分子的範圍的情況下，找不到活性分子，是概率比較低的。
對於這一點，我們課題組當然是清楚的，雙黃連作用於MCU發揮降低胞內鈣的作用，抓住這一個特徵，對一系列化合物進行篩查，就是最簡單有效的方式，當然我們也比其他任何人都希望能夠找到活性物質。
我們組並沒有光說不練。首先縮小範圍，雙黃連注射液的製備，是銀花和連翹混合提取，黃芩單獨提取，再混合兩個提取物得到最終的製劑， 所以我們讓藥廠分別提供了這兩個提取物做了活性測定，結果是，銀花連翹提取物具有降低胞內鈣的作用，而黃芩提取物沒有這個作用。
範圍縮小，鎖定到金銀花和連翹這兩個藥材上，通過查閱文獻，我們把這兩個化合物中已經報道含有的，市面上能夠買到的化合物標準品，在我們力所能及的範圍內盡量購買進行篩查，總共26種化合物。
同樣再用降低胞內鈣的指標進行篩選，僅僅發現五種化合物具有類似的作用，包括槲皮素，咖啡酸，烏索酸，D-(-)-奎寧酸和水楊酸甲酯。
需要注意的是，此處化合物劑量為10 μg/ml。
@幾用來包 提到過，2004年就有文章報道，一些天然黃酮類化合物能夠發揮直接激活MCU的作用，其中就包含雙黃連中含有的成分槲皮素。這一點與我們的研究結果是一致的，上文提到過，經過化合物的篩選，我們確實發現槲皮素能夠起到降低RBL-2H3細胞中胞內鈣含量的作用。
我們的文章中，確實沒有引用這篇文獻， @幾用來包 因此質疑我們檢索文獻能力有問題，或者為了發文章灌水對此故意視而不見。
實際上這裡的問題在於，在槲皮素能夠激活MCU的情況下，這就一定能說明槲皮素就是雙黃連注射液中發揮激活MCU作用的主要成分？
我的回答是：不能。
在此之前還需要說明一點，很多做葯的人對於黃酮類化合物是十分鄙視的，因為黃酮類成分很多具有非特異性的作用，在各種模型上都有各種效果，甚至有些雜誌因此不願意收黃酮類化合物的文章。
然而這種對於黃酮的認識是有問題的，在很多情況下，僅用「非特異性作用」並不能夠解釋所有問題。比如在這篇研究中，我們篩選的雙黃連成分中的26種化學成分，同樣是黃酮類成分除了槲皮素外，還有蘆丁，木犀草素，除黃酮外，還有黃酮苷如槲皮苷，金絲桃苷。這些黃酮或以黃酮為苷元的化合物，均沒有降低胞內鈣水平的作用，這難道可以用「非特異性作用」去解釋嗎？
顯然是解釋不通的。
繼續剛才的話題，為什麼在槲皮素已經報道對MCU激活作用的情況下，還不算尋找到了物質基礎。
關鍵問題在於劑量。
請記住知乎鐵律，任何情況下，無論拋開劑量談什麼，都是耍流氓。
在這篇研究的圖內可以看到，槲皮素的用量在5-40 μM，圖中箭頭所指的地方，在5 μM以下的劑量，槲皮素的作用就比較微弱，鈣水平曲線跟Control的差距就已經不太明顯了。而上文我也提到，我們組的研究以降低胞內鈣水平篩選有效成分時，使用的劑量是10 μg/ml，槲皮素的相對分子質量是302.24，10 μg/ml對應的摩爾濃度是33.09 μM。
然而在銀花連翹提取物中，我們恰好做了指紋圖譜，可以從液相的數據看到，槲皮素所出的峰的信號是很弱的，峰高只有10mV左右，這還是100%的雙黃連注射液，並不是實驗中所用的濃度2%，所以單從已經發表的數據上（補充材料中），就能大概看出雙黃連中所含的槲皮素應該是很少的。
那麼，我們做實驗所使用的雙黃連注射液中，到底含有多少槲皮素就成了關鍵問題。為了讓這個問題能夠更容易也更精準的回答，我還是實踐出真知吧，恰好我最近在走液相，我直接拿槲皮素的標準品走了一針。
當然，槲皮素的保留時間與文章中的不同這一點就不用糾結了，這次我只是想看槲皮素的出峰情況，所以直接用了最簡單的甲醇：水=50:50的體系，與文章中指紋圖譜的液相體系並不相同，所以保留時間沒啥意義，但是峰面積是可以參考的。
以峰面積的比例粗略計算，雙黃連注射液原液中所含的槲皮素，其濃度約6 μM，按照文章中的用量2%來計算，給與雙黃連後的細胞上清中，含有槲皮素的濃度在0.12 μM左右。
按照2004年的那個研究論文的結果來看，5 μM槲皮素促進鈣攝取的能力就極其有限，而再稀釋40倍後，2%雙黃連注射液中0.12 μM 的槲皮素又能發揮多大的激活MCU的作用，恐怕可想而知。如果按照我們自己文章的數據作為參照，33 μM的槲皮素對胞內鈣的抑制作用大概在10%左右，而按照給葯濃度計算，2%雙黃連中的槲皮素是此劑量稀釋了275分之一，如此少的含量，可以說能夠發揮的作用極其有限，幾乎可以忽略不計。
而與此同時，在同等條件下，2%的雙黃連所發揮的激活MCU降低胞內鈣的強作用，絕對不是其中含量微乎其微的槲皮素（約0.12 μM）所能代表的。換句話說，雙黃連中一定還有別的活性成分或者活性成分群，我們沒有找到。
這種情況下，難道還能說槲皮素是雙黃連中已知的激活MCU的主要活性成分？
寫這篇沒有別的意思，只是想說，不要輕易給人下「沒腦子」這種結論。用數據說話的人，不可能動動嘴皮子輕易否定。
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