碳青黴烯酶的研究進展

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碳青黴烯酶的研究進展

碳青黴烯類具有非常廣泛的抗菌活性，因能抵抗大多數內醯胺酶的水解，故常用於產超廣譜 -內醯胺酶（ESBL）和/或去阻遏 AmpC -內醯胺酶（AmpC）菌株引起嚴重感染的治療但碳青黴烯耐葯腸桿菌的出現，給臨床治療帶來了極大困難。通常，革蘭陰性菌對碳青黴烯類的耐葯機制，一是 AmpC 酶過度表達聯合OMP 丟失；二是 PBP 對碳青黴烯類親和力的改變；三是碳青黴烯酶（Carbapenemases）的產生在這些機制中，最突出的是碳青黴烯酶。

一、碳青黴烯酶的分類及有關細菌

碳青黴烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β-2內醯胺酶 ,包括 Ambler分子分類的 A、 B、 D 3類酶。

A類為絲氨酸酶 ,其活性部位具有絲氨酸結構 ,屬於 Bush分群中的第 2f亞組。A 類碳青黴烯酶少見 ,包括陰溝腸桿菌( I M I2 1和 NMC2 A)、黏質沙雷菌中由染色體介導的 NMC2 A、 Sme2 1、 Sme2 2、 Sme2 3、I M I2 1酶 ,以及肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌中質粒介導的 KPC1、GES2 2酶。這類酶都是青黴素酶 ,他們對亞胺培南的水解活性強於美羅培南 ,可以引起青黴素類、氨曲南、碳青黴烯類耐葯 ,而對第 3代頭孢菌素通常敏感。三唑巴坦、克拉維酸可以抑制此類酶 ,但不被乙二胺四乙酸 ( EDT A)所抑制。

Amble分類 D類為絲氨酸酶 ,屬於 Bush分群中的第 2d亞組，其活性部位具有絲氨酸結構 ,由blaOXA等位基因編碼 ,僅見於不動桿菌。

Amble分類 B類是金屬酶 ,屬於 Bush分類 3組 ,是一種需金屬離子發揮活性的β-內醯胺酶 ,由 bla I MP、 blaV I M、 blaSPM和 blaGI M編碼 ,可被EDT A所抑制 ,染色體介導或質粒介導,存在於多種不同革蘭陽性和革蘭陰性細菌中。金屬酶均可明顯水解亞胺培南,能水解除單環類抗菌藥物以外的絕大多數β-內醯胺類抗菌藥物,但對於其他β-內醯胺類抗菌藥物的水解能力有較大差異。臨床使用亞胺培南等碳青黴烯類抗菌藥物大大增加, 導致金屬β-內醯胺酶產生率有不斷上升的趨勢。目前尚未開發出有效的金屬酶抑製劑。

二、碳青黴烯酶的研究進展

對碳青黴烯酶的研究主要著重於對A、B、D 3類酶的種類、分布、生化特性、流行病學等的研究和相關菌株耐藥性的研究。

（一）A、D類碳青黴烯酶的研究

1、A類碳青黴烯酶的研究

自從 20年多前發現第一個 A 類碳青黴烯酶以來，至今已發現 6 群不同的酶，包括 GES、 KPC、 SME、 IMI/NMC-A 、SHV-38和 SFC-1，其中 GES、 KPC 和 IMI-2 由質粒編碼，其他均由染色體介導依據Bush-J-M 分類系統，這些酶分為 4個不同的表型

亞群，即 2br 、2be、 2e 和 2f 亞群。與其他 A 類 -內醯胺酶一

樣， A 類碳青黴烯酶利用活性位點絲氨酸殘基滅活 -內醯胺類藥物，可水解青黴素類、頭孢菌素類、單醯胺類和碳青黴烯類，這種活性可被克拉維酸和他唑巴坦所抑制，但對 EDTA 不敏感。

成熟A 類碳青黴烯酶是單體酶，含有 265~269 個氨基酸殘基，分子量為25~32kDa， pI 為 5.8~9.7。與其他絲氨酸酶一樣， A

類碳青黴烯酶也通過 3 步催化機制（包括醯化和脫醯基）來發揮作用。與 D 類和 B 類碳青黴烯酶一樣，對美羅培南的水解率低於亞胺培南，但對美羅培南的親和力卻始終高於亞胺培南。

儘管A 類碳青黴烯酶群體中的氨基酸序列一致性較低，但卻具有能使它們水解碳青黴烯類的相似的蛋白摺疊（Proteinfolds）。除SHV-38 以外， A 類碳青黴烯酶的一個共同特徵，是在Cys69和 Cys238之間均含有一個二硫鍵，這個鍵可以穩定蛋白摺疊。二硫鍵是水解所有 -內醯胺類所必需的，並非僅針對碳青黴烯類的水解，它是穩定酶結構的一種需要。

目前，產 A 類碳青黴烯酶菌株感染仍較少見，大多為零星出現 SME、IMI/NMC-A 和 SFC-1 均由染色體編碼，儘管對碳青黴烯類表現為高水平耐葯，但對超廣譜頭孢菌素仍保持敏感，因此，目前尚未引起廣泛的臨床問題。令人擔憂的是 KPC 和GES 酶的出現與擴散。

2、D類碳青黴烯酶的研究

1993年 , PAT ON等報道的第一個具有碳青黴烯酶活性的β-2 內醯胺酶 ,純化於 1985年分離於蘇格蘭愛丁堡病人的多重耐葯鮑曼不動桿菌,命名為 AR I2 1。。直到 2000年 ,DONALD等對 AR I2 1酶的氨基酸進行序列分析 ,將其命名為 OXA2 23。2000～2004年之間 ,在世界各地又發現了 6種新的 D類碳青黴烯酶。隨後又在許多國家碳青黴烯類耐葯菌株中發現了 7種 D類酶。迄今為止 ,在 121種 OXA型酶種 ,至少有 45種具有碳青黴烯酶活性。

成熟 D類碳青黴烯酶含有 243～260個氨基酸殘基 ,分子量為 23～35 . 5 kDa不等 , p I為 5 . 1～ > 9 . 0。該類酶對亞胺培南的水解速率是青黴素的 1%～3% ,對苯唑西林的水解速率是青黴素的 2倍 ,對三代頭孢菌素的水解活性很弱;其活性可被他唑巴坦和克拉維酸所抑制。

對攜帶編碼 D類碳青黴烯酶重組質粒的大腸埃希菌轉化結合子或轉化株的體外抗生素敏感性研究發現 ,它們對氨基青黴素和羧基青黴素高水平耐葯 ,對脲醯基青黴素的敏感性不定 (僅 OXA2 40和 OXA2 48對哌拉西林耐葯 ) ;對頭孢菌素類 ,包括窄譜頭孢菌素、氧亞氨基頭孢菌素和 72 α2 甲氧基頭孢菌素、氧頭孢烯類以及單醯胺類均敏感 (僅 OXA2 48對頭孢噻吩耐葯 )。除了 OXA2 23顯示哌拉西林在他唑巴坦存在下其M I C值降低 8倍以外 ,其他對克拉維酸和他唑巴坦的抑制作用不敏感。

通常 ,D類碳青黴烯酶表現出弱碳青黴烯水解活性 ,產該類酶的分離菌對碳青黴烯類的耐葯 ,可能是同時伴有其他耐葯機制的結果，如外膜孔蛋白丟失、泵出作用增強、青黴素結合蛋白 ( PBP)改變等。產 D類碳青黴烯酶 (OXA2 51除外 ) 均顯示對亞胺培南和美羅培南的高水平 (M I C > > 8 mg/L ) 耐葯 ,但在大腸埃希菌中僅表現為敏感性減低 (M I C ≤2mg/L),有力證明了其他耐葯機制的存在。PO I REL等報道的產 OXA2 48的肺炎克雷伯菌對碳青黴烯類高水平耐葯 (M I C = 64 mg/L ) ,可能是由於該菌株 blaOXA2 48基因與IS1999聯合導致 OXA2 48的過度產生、以及 36 kDa孔蛋白缺乏所致。產 OXA2 24的鮑曼不動桿菌中 ,由於 2種外膜孔蛋白

(22 kD和 33 kD)表達減低限制了外膜通透性 ,從而導致了對亞胺培南和美羅培南的高度耐葯 (其 M I C分別為 128和 256mg/L)。而產生 OXA2 23和 OXA2 58的鮑曼不動桿菌對碳青黴烯類的高水平 (M I C≥32 mg/L)耐葯 ,可能是 D類碳青黴烯酶的高度表達與泵出作用增強的結果。

此外 ,產 D類碳青黴烯酶的鮑曼不動桿菌也可對非β2 內醯胺類抗生素耐葯 ,如氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、氯黴素和四環素等。

D類碳青黴烯酶主要分布於臨床分離的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌 ,以 OXA2 23最為流行 ,其次是 OXA2 58和 OXA240。1998年以來 ,產 OXA2 23不動桿菌引起的醫院暴發感染見於世界各地 ,如巴西、英國、塔希提島等。韓國某醫院產 OXA2 23鮑曼不動桿菌的暴發感染持續了 8個月 ,涉及 36例病人。在我國 ,李蓉等報道了南昌鮑曼不動桿菌流行株 80%攜帶 OXA2 23基因。王輝等報道 ,在收集的來自 1999～2005年我國不同地區 11家教學醫院的 221株亞胺培南耐葯不動桿菌中 , 97 . 7%的菌株含有 OXA2 23樣基因 ,說明 OXA2 23在我國廣泛分布。

DA SI LVA等則報道了 1998～2003年分離於 3家葡萄牙大學醫院 162株亞胺培南耐葯鮑曼不動桿菌 ,所有菌株具有類似的多重耐葯模式 ,包括亞胺培南耐葯 (M I C > 32 mg/L)。結果顯示 ,多重耐葯鮑曼不動桿菌流行克隆攜帶blaOXA2 40 ,表明 OXA2 40在葡萄牙存在持續流行。2005年 , LO2LANS等報道了產 OXA2 40鮑曼不動桿菌在美國芝加哥多個城市引起的暴發感染 , 100株鮑曼不動桿菌中 , 97%均歸於1個克隆 ,說明在該地區為鮑曼不動桿菌的單克隆傳播。

實驗已經證明 ,細菌產生針對某一底物的低水平活性酶 ,當這個底物存在時可能促進這個酶更有效。從廣譜酶進化到超廣譜酶、耐酶抑製劑酶或碳青黴烯酶的現象在產SHV酶的銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌中已經得到證實。因此 ,可以預言 ,碳青黴烯類抗生素的廣泛應用可能導致銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌產生更有效的水解酶 ,其前景另人擔憂。

(二）相關菌株耐藥性的研究

1、鮑曼不動桿菌耐藥性及碳青黴烯酶的研究

　　鮑曼不動桿菌( A ci netobacter baumanni i , A .B aumanni i)是重要的醫院感染病原菌 ,在發生於下呼吸道醫院感染的革蘭陰性病原菌中 ,其僅次於大腸埃希菌和銅綠假單胞菌 ,居第三位。其耐葯率逐

年上升,出現了泛耐和全耐菌株 ,世界各地均有多重耐葯 A . B aumanni i 導致醫院感染流行的報道。在綜合性醫院的 ICU 及移植病房 ,常常因為多重耐葯A . B aumanni i感染導致最終的治療失敗。鮑曼不動桿菌對碳青黴烯類耐葯機制主要包括通透性降低、流出泵過度表達、碳青黴烯酶的產生。其中OXA型碳青黴烯酶是引起世界範圍鮑曼不動桿菌對碳青黴烯類藥物耐葯的最重要原因。

目前實驗研究顯示鮑曼不動桿菌對亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦較為敏感,對其他抗菌藥物耐葯情況嚴重;對耐碳青黴烯類藥物的菌株多重耐藥性尤其顯著,臨床應加強檢測和監測。主要方法為PCR檢測及基因序列分析。

魏艷艷對2005年安徽省部分醫院(18家)臨床分離的鮑曼不動桿菌的耐藥性進行了研究。結果顯示鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐葯率最低(6.4%)、其次為美羅培南(20.5%)和頭孢哌酮/舒巴坦(29.7%) ,對四環素的耐葯率最高(81.5%);其餘抗菌藥物耐葯率均在50%左右或以上。採用聚合酶鏈反應擴增IMP、VIM、OXA型碳青黴烯酶基因並測序並採用ERIC-PCR方法進行產酶菌株的同源性檢測顯示安徽省18家醫院分離出的耐亞胺培南和/或美羅培南鮑曼不動桿菌主要產OXA- 24型和IMP型碳青酶烯酶,部分菌株同時產2種或以上碳青黴烯酶,且少數產酶菌株間存在克隆傳播現象。

馮紅軍等對在平頂山市第一人民醫院收集到的亞胺培南耐菌株進行耐藥性分析 , 並對碳青黴烯酶基因進行了檢測。　217株鮑曼不動桿菌中頭孢哌酮 /舒巴坦耐葯率最低 ,其次是亞胺培南 ,再者是頭孢他啶和哌拉西林 /他唑巴坦。產 OXA2 23型β2 內醯胺酶是鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐葯的重要原因。周敏等的研究也顯示攜帶 OXA-23型碳青黴烯酶基因的鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌葯的耐葯率高其編碼基因為blaOXA-23。

另外，胡源等的研究表明碳青黴烯酶基因PCR擴增用於檢測鮑曼不動桿菌特異性較高,但如果僅從擴增片段長度判斷,存在出現假陰性的可能。

在國外，Heritier等通過質粒轉導的試驗證實Ade-ABC外排泵系統的過度表達聯合 OXA 酶的表達可以共同導致較高水平的耐葯可以推斷臨床中產碳青黴烯酶的不動桿菌對多種藥物的多重耐葯可能是由多種碳青黴烯酶共同作用並聯合其他機制，例如藥物靶位結合蛋白的變異導致與藥物親和力降低、細菌外膜蛋白通透性降低等所導致的高水平耐葯，各種耐葯機制之間的協同關係仍需進一步研究。

2、對肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶的研究進展

肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶( Klebsiella pneum oniaecarbapenemase , KPC酶 )最早在一株亞胺培南耐葯的肺炎克雷伯菌中被發現。從 2000年以後 ,KPC酶家族陸續在美國的新英格蘭和亞特蘭大地區被發現 ,主要在克雷伯菌屬中 ,也在其他菌株中被發現。由於腸桿菌是臨床上重要的醫院感染菌 ,其對碳青黴烯類抗菌藥物的耐葯給臨床抗感染治療帶來了極大困難。

在我國，2008年馮雅君等收集浙江大學醫學院附屬第一醫院2006年3月至9月住院患者連續分離、不重複的對碳青黴烯類抗生素敏感性下降的肺炎克雷伯菌10株，採用Etest法、電聚焦電泳(IEF)、聚合酶鏈反應(PCR)及序列分析、接合試驗等分析得到10株菌株對p一內醯胺類抗生素呈多重耐葯，但對多黏菌素．替加環素，復方SMz敏。質粒介導的KPC一2造成肺炎克雷伯菌對碳青黴烯類抗生素敏感性下降．並短暫流行；攜帶KPC一2基因的臨床菌株同時攜帶多種耐葯基因。

近幾年的研究表明KPC酶主要包括三類。

KPC 1酶 2001年有學者在美國北卡羅來納州肺炎克雷伯菌中發現由質粒介導的 KPC 1酶。耐葯表型表現出高度亞胺培南和美羅培南耐藥性 ,當存在克拉維酸時 ,針對亞胺培南和美羅培南的β2 內醯胺酶活性被抑制;對頭孢菌素類抗菌藥物和氨曲南也耐葯。KPC 1基因由大約 50 kb的非結合性質粒攜帶。基因測序顯示 ,核苷酸序列不同於基因庫中已有的編碼β2 內醯胺類酶的基因。氨基酸序列分析顯示 , KPC2 1與來源於黏質沙雷菌 S6的可水解碳青黴烯的β2 內醯胺酶 Sme2 1有45%的同源性 , 其他 3種 A類碳青黴烯酶 (Nmc2A、I M I2 1、 Sem2 1) 間在核酸水平上相互的相似性> 90% , 說明 KPC1酶可能具有與這 3種密切相關的 A類碳青黴烯酶不同的起源。 KPC 1酶是一種新的屬於 A類 Bush 2f組的可水解碳青黴烯的β2 內醯胺酶 , 肺炎克雷伯菌 1534的碳青黴烯耐藥性主要由 KPC 1酶介導 , 孔蛋白表達的改變可能也起了某種作用。

KPC 2酶　2002年報道 , 1998年在馬里蘭州一名 4歲腹瀉患兒糞便里分離出一株沙門菌(AM04707) ,出現了耐大多數β2 內醯胺類抗菌藥物和亞胺培南的表型 ,檢測出 KPC22酶。2003年 ,國際癌症研究協會 ( I CARE)項目報道了在1998年紐約州醫院發現一株產酸克雷伯菌 (產酸克 3127)產 KPC 2酶。KPC 2酶與 KPC 1酶有一個氨基酸的改變，S174G,分類也屬於 A類 Bush 2f組。。KPC 2酶從腸炎沙門菌和肺炎克雷伯菌而來 ,DNA序列表明 ,編碼 KPC 2的質粒與沙門菌中的質粒有 98%的同源性 ,因此 ,此質粒可在腸桿菌中結合而傳播 KPC 2。KPC 2酶能單獨引起碳青黴烯類耐葯 ,不依賴於膜孔蛋白的丟失 ,基因由可轉移的70 kb質粒編碼 ,位於質粒的轉座子上 ,具有高傳播可能。Smith Moland等在一株肺炎克雷伯菌中發現 KPC酶的同時 ,表型試驗檢測到菌株超廣譜β2 內醯胺酶 ( ES BL s)陽性 ,產 ES BL s為臨床檢測 KPC- 2酶帶來一定困難。

KPC 3酶　2000年4月至2001年4月 ,紐約 TISCH醫院的重症監護病房有 24例患者被感染了碳青黴烯類耐葯的肺炎克雷伯菌 ,這是首次報道的亞胺培南耐葯的肺炎克雷伯菌引起的感染。凝膠脈衝場電泳 ( PFGE)證實了此次醫院感染由 3個不同的克隆株引起,分別為 CL5761、CL5762、 CL5763。聚合酶鏈反應 ( PCR)擴增發現了一種新的 KPC酶 — — —KPC 3酶。葯敏結果顯示 ,對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、哌拉西林、三唑巴坦、慶大黴素敏感性降低 ,但對四環素敏感。KPC2 3由 75 kb的質粒編碼 ,可以結合轉移。KPC3酶是由 882 bp的鹼基編碼的 293個氨基酸殘基的肽鏈 ,和 KPC 1酶相比有 2個鹼基的改變。可通過電穿孔轉移和結合。結合實驗發現 ,所有的 KPC結合子對碳青黴烯類的葯敏比原菌株要敏感。KPC-1、KPC-3 酶均需要結合膜孔蛋白ompK35,其表達缺失引起對碳青黴烯類的耐葯。

目前產 KPC酶的細菌已經在全球範圍內廣泛播撒,中國也已經報道,造成了對碳青黴烯類、青黴素類、頭孢菌素類和氨曲南在內的幾乎所有β2 內醯胺類抗菌藥物耐葯,並且產 KPC酶的菌株種類正在增加,隨時可能引起醫院感染的爆發和流行,因此產 KPC酶細菌的感染將是我們面臨的嚴重問題,應引起微生物學家和臨床醫師的高度重視。

3、銅綠假單胞菌的耐藥性及碳青黴烯酶的研究進展

銅綠假單胞菌是一種常見的醫院內獲得性感染條件致病菌，在醫院感染病原菌中檢出率最高。該菌耐藥性強，耐葯譜廣，對多種抗菌藥物表現為天然或獲得性耐葯，故其所致感染可供選擇的有效抗菌藥物甚少。碳青黴烯類抗生素是目前臨床上使用的抗銅綠假單胞菌較為有效的藥物，但隨著臨床的廣泛應用，銅綠假單胞菌對亞胺培南等產生了耐藥性，使得臨床上對耐碳青黴烯類抗生素的銅綠假單胞菌治療極為困難。

從２０世紀９０年代有報道以來，銅綠假單胞菌耐葯率呈明顯上升勢頭。哥倫比亞一家有著１９５個床位的中心分離出的銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐葯率從１９９６年的２％、１９９７年的２８％，到２００３年超過了4０％。中國上海２００４年分離出的２２８７株銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐葯率為２1 ％。

其耐葯機制主要有：①碳青黴烯酶的產生；②藥物作用靶點的改變；③主動外排泵的過量表達；④高產AmpC酶伴外膜孔蛋白的丟失。碳青黴烯酶可由細菌染色體編碼，也可由質粒編碼，一旦染色體編碼的耐葯基因轉移到可傳遞的質粒上，可與質粒上其它耐葯基因組合在一起形成多重耐葯，並導致耐藥性的傳播。OXA50型酶是唯一一個在銅綠假單胞菌中發現的D類碳青黴烯酶。該酶位於染色體上，它編碼的蛋白質是poxB酶(D類)的前體。

郝維敏等用法國梅里埃公司的VITEK32全自動細菌鑒定與葯敏系統檢測其耐藥性，用雙紙片協同法檢測銅綠假單胞菌產金屬酶得出　IRPA（亞胺培南耐葯的PA）對抗菌藥物的耐葯率明顯高於ISPA（亞胺培南敏感的PA）且呈多重耐葯 ,產金屬酶是銅綠假單胞菌耐亞胺培南的主要機制之一。

參考文獻

1. 魏艷艷鮑曼不動桿菌的耐藥性及B類和D類碳青黴烯酶的研究安徽醫科大學2009

2. 胡源,何利華,張建中 bla_(OXA-51-like)碳青黴烯酶基因PCR擴增用於鮑曼不動桿菌檢測的可行性評價中國病原生物學雜誌

3. 李金鐘 A類碳青黴烯酶的研究進展中國熱帶醫學2009年第9卷第5期

4. 李金鐘 D類碳青黴烯酶的研究進展中國微生態學雜誌2009年 6月第 21卷第 6期

5. 周敏,黃茂,梅亞寧鮑曼不動桿菌OXA23 型碳青黴烯酶相關耐葯基因分析南京醫科大學學報（自然科學版）第29卷第8期2009 年 8 月

6. 馮紅軍,牛麗林,李花茹,付玉軍,牛勝利,米彩鋒鮑曼不動桿菌耐藥性及碳青黴烯酶的研究中國實用醫藥 2009年3月第4卷第 7期

7. 杜蓉,馮萍,陳慧莉,俞汝佳,高燕渝,史映紅,孫菡,王亞娟鮑曼不動桿菌臨床分離株耐藥性與 OXA碳青黴烯酶基因型研究四川大學學報( 醫學版)2009 ; 40( 2) :272 2 274 　　

8. 湯瑾,李卿,蔣燕群對肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶的研究進展檢驗醫學2010年月第25卷第1期

9. 馮雅君,沈萍,杜小幸,俞雲松,李蘭娟產碳青黴烯酶KPC一2肺炎克雷伯菌局部流行

10. OXA--50型碳青黴烯酶基因在銅綠假單胞菌中分布的初步研究

中國抗生素雜誌

11. 郝維敏,劉傑,楊曉春耐亞胺培南銅綠假單胞菌產金屬酶及耐葯監測　中華全科醫學2009年4月第 7卷第4期

（2010-7-13）