一管血實現癌症檢查，靠譜嗎？

癌症診斷會變得像血糖檢驗一樣容易嗎？僅憑一管液體就可能使癌症診斷、療效評估、實時監控、個體化用藥變為可能？

MIT Technology Review 公布的2015年度十大突破技術之一——液體活檢（liquid biopsy），以其簡單易行、靈敏特異、無創或微創，近來給傳統癌症治療帶來顛覆性變革。

對於癌症患者甚至普通的健康人群，這一技術到底意味著什麼呢？（想知道結果的可以直接拉到文末）

首先需要了解液體活檢的概念和檢測對象。所謂「液體活檢」，即從血液、尿液、唾液等體液中捕捉遊離的腫瘤核酸、囊泡、腫瘤細胞等，對疾病（如癌症）的標記物進行分子生物學檢測。 廣義液體活檢的對象主要包括三類：遊離核酸、囊泡或完整的細胞，如圖所示[1]。

液體活檢的檢測對象

我們接下來將撰文對三類生物標記物一一介紹。本文首先詳細介紹明星分子循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）。

ctDNA的發現史

早在1948年，Mandel和Metais就從正常人血液中檢測到遊離的DNA 片段 （cell-free DNA, cfDNA）。1977年Leon等人發現腫瘤患者體內cfDNA含量明顯高於健康個體，而晚期腫瘤患者含量更高。隨著研究不斷深入，研究者發現在腫瘤患者的血漿和血清cfDNA中，存在與腫瘤基因改變相同的DNA片段，命名為ctDNA（circulating tumor DNA）[2]。

ctDNA的生物學特性

由於巨噬細胞等清道夫的清除作用，通常體液中遊離核酸會被實時清除並保持極低含量，每一毫升血漿中，大約只有十幾納克（ng）的cfDNA。比如常規科研實踐採集10毫升的血液里，有約2萬細胞的cfDNA。但在腫瘤組織中，細胞代謝旺盛導致大量細胞凋亡和壞死，增加釋放遊離核酸。

癌症患者血液中含有突變片段的ctDNA佔cfDNA比例0.01%~90%不等，ctDNA含量與腫瘤類型、腫瘤負荷和腫瘤進展等相關。

一般來說，癌症越晚期的病人，ctDNA的水平越高。片段化、低含量的ctDNA有一些獨有特徵，如圖所示[3]。

ctDNA 的生物學特性

ctDNA的檢測技術

常用ctDNA的檢測分析方法包括：定量PCR，微滴數字式PCR, BEAMing，標記擴增深度測序方法, 癌症個體化建檔深度測序分析方法，全基因組測序，全外顯子測序等。[4]

可以對ctDNA進行定性分析，包括檢測基因突變、缺失、插入、融合、重排、拷貝數變異、甲基化、微衛星不穩定（MSI）和雜合性缺失（LOH）等；也可以對ctDNA濃度進行定量分析。定性和定量兩種方法均可以反映腫瘤的存在和嚴重程度。

超敏感ctDNA檢測技術CAPP-Seq

ctDNA的臨床應用

傳統癌症治療中，醫生通過手術或穿刺針取出腫瘤樣本，在顯微鏡下觀察病理組織切片並進行遺傳學分析，做出診斷指導治療。這種方法具有侵入性和一定風險，而且比較昂貴。對於腫瘤演化產生異質性和抗藥性，以及轉移期患者體內存在多個腫瘤病灶，單次原位活檢存在很大局限。

液體活檢ctDNA通過低創無創的方式，讓病人擺脫傳統組織活檢的痛苦，實時多次獲取腫瘤基因組信息，大大提高檢測的靈敏度和準確性，可能在臨床醫學有多方面應用。

1術後判斷

通過檢測ctDNA水平評估手術效果，判斷腫瘤是否已經切除乾淨。

比如約翰斯霍普金斯醫學院的 Velculescu 等研究人員從101例II期胰腺癌患者同時收集腫瘤標本和血液樣本，進行全外顯子組測序。在接受腫瘤切除的早期胰腺癌患者中，如果檢測不到ctDNA說明手術成功預後較好，如果檢測到ctDNA，可能有殘留組織預後較差，更容易複發，兩組病人存在顯著差異。同時，與標準CT影像學相比，ctDNA可以提前6.5個月檢測到腫瘤複發[5]。

檢測ctDNA輔助術後判斷

2動態監測

以ctDNA作為腫瘤標誌物，多次取樣定性定量檢測腫瘤負荷，監控疾病複發；同時還可以追蹤藥物響應，通過藥物療效信息及時採取進一步治療。

當靶向葯有效時，ctDNA中藥物敏感的腫瘤特異突變減少，一旦產生耐葯，ctDNA中耐葯突變增加。目前在肝癌、乳腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種癌症中都有報道。最經典的案例之一是來自劍橋大學的研究人員對一名乳腺癌患者長達3年之久的追蹤研究。Muhammed Murtaza與同事對一名腫瘤擴散至身體其它部位的乳腺癌患者，分別採集腫瘤樣本（活檢）和血液樣本，他們仔細對比了同一時間點採集的ctDNA和活體組織切片。血液樣本中的遊離腫瘤DNA與活體腫瘤樣本測序結果相匹配，反映了當腫瘤進展和響應藥物治療時的相同模式和遺傳變化，說明ctDNA可以時時監控疾病情況，輔助調整治療方案[6]。

檢測ctDNA動態監測腫瘤

3用藥指導

通過對ctDNA中腫瘤特異的突變檢測，能夠有效反映病人對治療的響應。取治療前後的血漿樣本，對ctDNA測序鑒定藥物治療過程中產生的耐葯突變。

比如斯坦福大學Maximilian Diehn教授及其團隊採用新研發的高敏感ctDNA檢測方法CAPP-Seq，分別對早、晚期非小細胞癌患者進行檢測。1名VI期非小細胞肺癌患者在接受3個月化療治療後通過影像學檢查發現腫瘤縮小，同時ctDNA水平有所下降。但8個月後，患者ctDNA水平呈現升高，提示隱匿微小腫瘤病灶出現進展。通過對ctDNA檢測發現患者存在ALK融合基因，隨即使用 ALK融合基因靶向藥物克唑替尼進行治療，患者病情得到很大改善，ctDNA水平也再次降低[4]。

檢測ctDNA指導用藥方案

4異質評估

癌症在病人體內不斷分裂產生新的基因變異，進化出藥物抗性使癌細胞繼續存活並增殖。ctDNA可以作為有效標記物，評估腫瘤異質性。

英國癌症研究院的Isaac Garcia-Murillas博士團隊，對55位以手術和化療為根治性治療的早期乳腺癌患者進行ctDNA追蹤，在不同個體中，檢測到ctDNA的突變可能只出現在原發瘤或只出現在轉移瘤，也可能同時出現兩類腫瘤組織[7]。MuhammedMurtaza等用貝葉斯聚類方法PyClone對共發現的207個功能性突變進行聚類，探索出三組主要腫瘤異種。一組突變主要發生在癌症進化早期，一組突變在所有轉移性腫瘤樣本中存在高丰度，但在原發腫瘤中不易發現，還有一組突變具有相對多樣性，分散在不同時期的腫瘤活檢樣本中。血液樣本中ctDNA含有的隨機突變反映了腫瘤單克隆群的不同大小和活性，並揭示出腫瘤異質性變化的順序[6]。

檢測ctDNA進行異質評估

ctDNA的更多進展

除了研究血液中的ctDNA，科學家也在積極探索腦脊液ctDNA作為腦腫瘤液體活檢標誌物克服血腦屏障影響[8]，另有最新報道肺癌患者唾液中ctDNA呈現與血液ctDNA相近的檢測效果[9]。美國公司trovagene堅持多年燒錢探索樣源豐富的尿液循環腫瘤DNA標記物等等。ctDNA檢測已獲得一些臨床和相關機構認可，比如歐盟和中國藥品監管局先後於2014年、2015年批准阿斯利康易瑞沙（Iressa）血液ctDNA伴隨診斷，用於篩查腫瘤組織不可評估的患者人群。 [10]

不僅臨床科研領域ctDNA在癌症篩查和監測等多個層面發展迅速，諸多企業也紛紛湧入開拓市場。連世界著名基因測序儀巨頭Illumina也按捺不住，2016年初組建新公司Grail（聖杯）加入液體活檢領域，專攻ctDNA在早期腫瘤檢測中的應用，吸引蓋茨基金、亞馬遜創始人傑夫·貝佐斯等多家資金約1億美元投資（要跟土豪交朋友！）。

介紹了這麼多，ctDNA在腫瘤檢測、評估、用藥中有如此神奇的威力，大家肯定很關心：

健康人群有必要做ctDNA檢測嗎？且慢！！

儘管潛力巨大，目前ctDNA還無法成為臨床上的主要診療手段。

· 早期癌症ctDNA檢測難度大。

即使採用超敏感的CAPP-Seq，ctDNA在II-IV期的非小細胞肺癌患者NSCLC中檢測敏感性100%，而I期的NSCLC中敏感性僅為50%[4]。與之類似，在近十種640例癌症患者中的研究也報道，47%的I期癌症患者、55%的II期癌症患者、69%的III期癌症患者以及82%的IV期癌症患者可檢測到血液中ctDNA[10] 。也就是說在腫瘤早期篩查方面，僅通過檢測ctDNA來診斷癌症的患病風險還有很長的道路要走。

· 不同腫瘤組織中，ctDNA的含量差異很大。

比如在Bettegowda的研究中，只有不到50%的髓母細胞瘤、轉移性腎癌、前列腺癌或甲狀腺癌，以及不到10%的膠質瘤患者可以檢測到ctDNA，而在超過75%的晚期胰腺癌，卵巢癌、結直腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌以及頭頸癌可以檢測到ctDNA[11]。

不同腫瘤組織ctDNA含量差異大

· 檢測結果參差不齊。

ctDNA檢測方法需要加強流程規範。包括前期血液處理過程和提取cfDNA方法標準化，提高檢測的可重複性。

· 臨床實踐依然昂貴。

特別是採用更為有效和全面的二代測序技術，目前價格還比較昂貴，有待進一步降低循環腫瘤核酸的檢測成本。

小結

ctDNA檢測：

· 臨床優勢：無創無損，靈敏特異，實時多次，廣泛全面

· 臨床應用：術後判斷，動態監測，用藥指導，異質評估

儘管ctDNA檢驗技術還有待成熟，需要儘快建立統一的臨床標準，正如加州大學舊金山分校瘤遺傳學項目負責人John Witte所說：「重要的是要保持良好的懷疑態度」。利用精確特異的ctDNA檢測，幫助醫生像偵探一樣敏銳監控癌症進展，跟蹤抗性突變，及時指導用藥方案。

「將癌症從一種致命疾病轉變為一種慢性病還有多遠？」

道路是曲折的，前途是光明的，讓我們共同拭目以待吧。

【作者簡介】李妙竹，博士就讀中科院上海生命科學院，師從遺傳學家賀林院士。目前在杜克大學做人類基因組數據分析，系統性探索衰老和長壽的奧秘。

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