甲基化：給DNA戴上帽子

06-06

RNAi機制甲基化：給DNA戴上帽子

DNA甲基化與遺傳物質的穩定性

在生物個體的生長發育與繁殖過程中，維持遺傳物質的穩定性是至關重要的。細胞採用多種機制來保證DNA複製的忠實性，如DNA的雙螺旋結構與半保留複製模式為遺傳物質的穩定提供了物質基礎；DNA聚合酶Ⅲ除了具有DNA聚合酶活性外還具有5』到3』的核酸外切酶活性，可及時去除錯配摻人的鹼基；DNA複製後存在多種修復機制進一步保證了遺傳物質的穩定性。DNA甲基化在DNA複製起始、錯配修復、細菌中寄主控制的修飾與限制以及轉座子的失活等過程中對維持遺傳信息的穩定性發揮著重要的作用。

DNA甲基化與基因表達調控

在真核生物基因組中，基因僅僅佔一小部分，例如在人類基因組中基因的編碼序列還不到2％，那麼在大量非編碼DNA存在的情況下，實現精確控制基因的表達，降低周圍的轉錄噪音對生物體至關重要。DNA甲基化作為一種可遺傳的修飾方式為非編碼DNA(內含子、重複元件以及潛在的具有活性的轉座子)的長期沉默提供了一種有效的抑制機制010]。DNA複製後胞嘧啶的甲基化會改變DNA的構象，使DNA的大溝無法與DNA結合蛋白正常結合，從而使這些非編碼區長期保持無表達活性的狀態。而有轉錄活性的基因可利用非甲基化的啟動子來進行轉錄表達，即使在相鄰的非轉錄區是高度甲基化的，其啟動子仍然可以起始轉錄並被調控。

DNA甲基化與表觀遺傳學

過去人們一直以為遺傳和環境兩大因素共同決定生物體的性狀，然而人們無法合理解釋馬和驢的正反交後代、同卵雙胞胎差別以及x染色體失活等現象。1942年Waddington首次提出了表觀遺傳學(epigenetics)的概念，它針對研究基因型與表型的關係，使經典的孟德爾核內遺傳規律無法解釋的現象得到了合理而完美的解釋。基因組表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化修飾與核小體中組蛋白的修飾等，使得被修飾DNA的空間結構發生改變或使染色體結構發生改變，導致基因的沉默或過度表達。這兩種修飾都是在不改變DNA鹼基種類與數量的前提下使生物體表型呈現出多樣化。DNA甲基化對基因表達模式以及基因組穩定性均起著至關重要的作用，並在印跡基因與x染色體失活等典型的表觀遺傳現象中起重要作用。

DNA甲基化與胚胎髮育

DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細胞增殖過程中通過依賴於DNA複製的DNA甲基轉移酶Dnmtl穩定地傳遞給子細胞。但在胚胎髮育的不同時期，基因組範圍內的DNA甲基化水平會發生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎髮育階段，甲基化模式在配子形成時已經建立舊1。DNA甲基化對胚胎正常發育和等位基因的選擇表達至關重要。錯誤甲基化模式的建立將引起人類的疾病，如Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征和脆性x染色體綜合征等。

甲基化的檢測方法甲基化：給DNA戴上帽子

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發生於胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5』-端的胞嘧啶轉變為5』-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，導致抑癌基因表達的下降。

甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產物克隆至載體後進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。

高解析度熔解曲線法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾後的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理後，未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增後轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發生改變，從而導致熔解溫度的變化

甲基化與腫瘤甲基化：給DNA戴上帽子

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基化轉移酶（DNMT）催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉移至DNA鏈中特定鹼基上的化學修飾過程。哺乳動物基因組中，DNA甲基化多發生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一種表觀（epigenetic）修飾，它在不改變DNA序列的情況下，對個體的生長、發育、基因表達模式以及基因組的穩定性起到重要的調控作用，並且這種修飾在發育和細胞增殖的過程中是可以穩定傳遞的。近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發生、發展、細胞癌變有著密切的聯繫。

DNA甲基化作為腫瘤生物標誌物

DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現在以下幾個方面：一是甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變；二是抑癌基因和DNA修復基因由於超甲基化而沉默；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因組總體甲基化水平降低使轉座子、重複序列活化導致染色體穩定性下降。這些因素是導致腫瘤發展、轉移、惡化最終導致患者死亡的重要原因。DNA總體甲基化水平（即甲基化譜）和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標。

甲基化與腫瘤侵襲和轉移

DNA甲基化在腫瘤轉移過程中發揮著重要作用，如有研究發現了數個可以誘導EMT的轉錄因子，在正常細胞中它們表現為高甲基化水平因而其表達受到抑制，但在腫瘤細胞中它們的甲基化水平偏低而出現高表達。利用DNA甲基轉移酶（methyltransferase）抑製劑5-氮雜胞苷（5-aza-cytidine）處理MCF-7乳腺癌細胞，使其維持低甲基化狀態，結果顯示與EMT過程相關的促細胞侵襲基因（pro-invasive EMT-associated gene）表達上調，細胞的侵襲能力和轉移能力增強。此類研究結果值得我們深思，採用DNA甲基轉移酶抑製劑來治療腫瘤固然可能抑制原癌基因的表達，但也可能造成腫瘤細胞轉移播散增加的風險。

甲基化與腫瘤治療

腫瘤預防和治療的一個手段是通過去甲基化恢復某些關鍵的抑癌基因或DNA修復基因的活性，目前研究最多的是DNMTs抑製劑，它通過抑制DNMT活性以逆轉異常的DNA甲基化。第一個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2"-deoxycytidine（5-aza-CdR），這類藥物已經美國FDA批准用於白血病前骨髓增生異常綜合征的治療。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物，在DNA複製過程中可以摻入到DNA鏈中，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力，另一方面它抑制DNMT活性，導致DNA甲基化水平的降低。體外和體內試驗均表明，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑癌基因甲基化水平從而抑制腫瘤的能力，臨床表明應用5-aza-CdR可提高部分IV期小細胞肺癌患者生存率，但該葯也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強，不能針對某一特定抑癌基因進行靶向治療；高劑量的5-aza-CdR可能誘發腫瘤的轉移），因此其在臨床上的應用受到了很大限制。也有研究表明，低劑量的As2O3可起到治療肝癌的目的。

甲基化研究前沿甲基化：給DNA戴上帽子

突破性測序技術繪製甲基化圖譜

美國科學家通過一種稱作單分子實時（SMRT）DNA測序的新技術，研究人員首次繪製了致病菌全基因組甲基化標記圖譜。通過比較相關菌株之間的甲基化模式，他們發現了稱作噬菌體的病毒感染細菌顯著改變宿主的一種方式。進一步研究對改變大腸桿菌特性至關重要的甲基基團將有助於研究人員了解甲基化對細菌生命周期、傳染力、甚至或許是耐藥性的作用。[詳細]

信使RNA中存在高水平的甲基化現象

康奈爾大學的研究者發現，信使RNA—DNA的鏡像拷貝，指導蛋白質合成—也會發生甲基化。對大鼠的各種組織進行分別的分析之後發現，甲基化的RNA集中在大腦、肝及腎臟中。並且，來自大鼠胚胎的樣本分析表明，當胚胎大腦進入到生長的後期時，這種RNA的濃度上升了70倍，從而說明這些甲基化RNA很可能在發育中發揮基本作用。基化的腺嘌呤容易成簇出現在RNA鏈上蛋白質合成完成的位點，其他的蛋白質結合到這個區域改變或終止蛋白質的生產。這就表明，這種甲基化可能發揮著指導蛋白質合成時機及合成量的作用。[詳細]

機體存在DNA主動去甲基化調控機制

浙江大學生命科學學院細胞與發育生物學研究所的研究人員以間充質幹細胞成骨分化為實驗模型,中證實機體存在DNA主動去甲基化調控機制，生長阻滯與DNA損傷誘導蛋白Gadd45a在該過程中發揮了關鍵作用。研究發現，Gadd45a介導的成骨基因表達的去甲基化調控主要發生於啟動子的CpG島外（island shore）中等密度區，而非通常認為的高密度CpG島，而且Gadd45a介導的主動去甲基化主要發生在若干特定的CpG位點上。從而提出在DNA主動去甲基化過程中可能存在一種位點特異性去甲基化機制。[詳細]

DNA去甲基化機制研究發現一種新的修飾鹼基

中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所的工作證明，DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet家族的雙加氧酶進一步氧化為第7種鹼基：5-羧基胞嘧啶（5caC）；此外，胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）可以特異性地識別這一新的鹼基修飾形式，並將其從基因組中切除。[詳細]