血栓與抗凝治療監測的靶向時代

數十年來,整體凝血功能試驗在術前出血風險評估?凝血因子缺乏性疾病篩查?口服維生素K拮抗劑(vitamin K Antagonist,VKA)和普通肝素抗凝的療效評估中發揮了重要作用?如VKAs的治療劑量需要2至4周時間通過國際標準化比值(International Normalized Ratio,INR)進行調整[1],INR<2.0時複發vte風險增高,inr>3.0時主要出血事件增加[2],因此需定期檢測INR來監測抗凝治療效果?另一方面,頻繁的有創檢查也降低了患者依從性,難以保證藥物效果的穩定,增加了治療風險?為了減少定期監測並提高藥物的安全性,新型的直介面服抗凝葯(direct oral anticoagulants,DOACs)應運而生,近年來的大量臨床試驗證明,DOACs治療非瓣膜性房顫(non-valvular atrial fibrillation,NVAF)和急性靜脈血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)的安全性和有效性優於VKAs和普通肝素[3],然而,部分患者(腎病?老年等)因藥物代謝差異,其用藥安全仍有必要監測?在藥物更新換代的大背景下,傳統凝血篩查試驗的局限性逐漸暴露出來,成為臨床亟需解決的問題?

單靶點抗凝治療呼喚靶向監測

直介面服抗凝藥包括活化X因子(Xa)抑製劑和活化II因子(IIa)抑製劑(直接凝血酶抑製劑),其中前者(利伐沙班,阿哌沙班等)通過阻斷凝血酶原轉化為凝血酶而發揮抗凝作用,後者(達比加群等(達比加群酯等)選擇性地與可溶性或纖維蛋白結合的凝血酶作用,防止凝血級聯反應放大,阻止纖維蛋白原轉化為纖維蛋白?

臨床常用劑量的利伐沙班可使凝血酶原時間(prothrombin time,PT)延長,延長程度與血葯濃度僅呈弱相關,且存在著試劑依賴的變異性?PT除了受試劑類型多樣性及檢測系統差異的影響之外^[4],檢測低劑量達比加群酯的靈敏度低且變異性大^[5],PT正常僅用於排除血葯濃度高的可能,或者說抗凝過量的風險較低?此外,PT用於監測阿哌沙班也有靈敏度低?可靠性差?實用性局限的問題^[6]?

活化部分凝血活酶時間(APTT,Activated Partial Thromboplastin Time)對於利伐沙班的敏感性比PT更低^[7],也不適合監測阿哌沙班劑量^[8]?由於缺乏劑量依賴關係,APTT不能可靠地判斷達比加群酯劑量達標與否,個體差異顯著而且同樣受儀器和檢測試劑的影響^[9-10]?例如,18%的達比加群酯抗凝劑量達標者的APTT仍在健康人參考區間內,而美國血液學會指南曾提出,APTT正常可排除達比加群酯劑量過高導致的出血;英國血液學標準委員會指出100ng/mL達比加群酯可使APTT延長,APTT比率正常基本可以排除達比加群酯過量^[11],而現實情況是,15%~35%患者在劑量高於100 ng/ml時APTT仍未延長^[12],因此APTT並不是該葯監測的可靠手段?由此看來,APTT變異性大的難題從方法學建立伊始,歷經肝素劑量監測到新型口服抗凝葯面世,一直制約著其自身有效應用?

凝血酶時間(thrombin time,TT)對低劑量達比加群酯非常敏感^[13],隨著濃度增加出現明顯延長,劑量較高時TT就超出檢測上限^[14],簡言之,TT正常提示血漿中沒有或僅有很少達比加群,一旦顯效則TT迅速超出檢測上限?活化凝血時間(Activated clotting time,ACT)對達比加群酯治療劑量缺乏敏感性,只與高血葯濃度相關:APTT正常可以排除50%以上的過量者,ACT或PT正常可以排除75%?

上述通過血漿凝固時間反映抗凝活性的試驗有助於判斷顯效與否,但由於由於缺乏良好的劑量-效應關係,臨床上難以通過凝固時間長短來調整劑量,而且這種定性試驗存在誤判風險?

普通肝素(unfractionated heparin,UFH)?低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)和磺達肝癸鈉用於急性期靜脈血栓的標準治療?為了安全有效地使用UFH,治療範圍通常維持APTT處於正常值的1.5~2.0倍,實際上這種方式是囿於APTT技術局限性的選擇,依賴於試劑種類的治療區間不能完全糾正APTT的變異?即便用自動化凝血分析儀測定血漿肝素濃度與APTT,兩者間無論是線性回歸還是對數轉換,偏差和相關係數仍有很大變異,從而影響臨床決策的可靠性?在啟動抗凝治療時,根據體重計算的固定劑量LMWH皮下給葯,減少了對實驗室監測的依賴?儘管LMWH和磺達肝癸鈉顯著降低了出血風險,仍然需要評估部分患者體內藥物的抗凝活性,對於肌酐清除率低於30 ml/min的腎功能受損患者,需要減量?延長注射間隔?改用UFH(大分子量片段較少經腎臟代謝),必要時需監測抗Xa?

抗Xa活性試驗定量檢測的是血漿中肝素類藥物的抗凝水平,與血漿利伐沙班水平相關性良好,用藥物標準品繪製抗Xa定標曲線降低了反應變異性並提高了靈敏度和特異性^[15]?根據抗Xa標準曲線校準APTT減少了不同試劑對肝素敏感性的差異造成的複雜干擾,CAP和ACCP推薦肝素治療時基於APTT參考區間的抗Xa活性為0.3~0.7 IU/ml?對於狼瘡抗凝物陽性?內源性凝血因子(Ⅷ?Ⅸ?Ⅺ)或者接觸因子(Ⅻ,激肽釋放酶,高分子量激肽原)缺乏的患者,用APTT監測UFH也不可靠,應選用抗Xa活性試驗?一歲以下的兒童因抗凝血酶濃度各異且APTT反應不確定,也推薦抗Xa活性試驗定量監測肝素使用^[16]?

蝰蛇毒凝血時間(ecarin clotting time,ECT或ecarin chromogenic assay,ECA)和稀釋凝血酶時間(diluted thrombin time,dTT)受制於方法學的最低檢出限(主要是定標品的因素),對低於30~40 ng/ml需要濃度的達比加群酯敏感性不足,但對治療劑量和超劑量達比加群酯的敏感性良好,體內和體外實驗都顯示上述試驗與血葯濃度的良好線性關係^[17],能夠反映治療劑量範圍內達比加群酯的準確劑量?

利伐沙班的Ⅱ期臨床試驗表明血葯濃度與VTE或出血有關^[18],Ⅲ期臨床試驗改為每日固定劑量不再實驗室監測?實際上,服用DOACs後血漿谷值和峰值波動很大^[19],不利於確定治療範圍和報告解釋?更為危險的是,目前國內還沒有針對DOACs的適當逆轉藥物,達比加群酯尚可通過血液透析緩解,利伐沙班和阿哌沙班由於與蛋白結合牢固,即使血透也難以有效逆轉抗凝效應?因此處理大出血事件,了解藥物濃度有助於分析原因?

方法學標準化有助於減少結果變異性,比如嚴格控制DOACs服藥和采血之間的時間,可避免藥物代謝造成的結果波動,便於DOACs濃度的解釋?目前絕大多數臨床實驗室還不能開展對抗Ⅹa和Ⅱa(明確一下是抗Ⅹa和Ⅱa還是Ⅹa和Ⅱa)Ⅱa活性檢測,就出現了用PT?APTT或者TT大致判斷DOACs抗凝效果的方式,但是傳統凝血功能檢驗的準確度和可靠性有限^[20],其結果需謹慎解讀?目前存在的問題是,基於發色底物法的抗Ⅹa活性檢測可受到高膽紅素和高脂血症影響,同時UFH具有抗Ⅹa和抗Ⅱa的雙重作用,單純抗Ⅹa不能完全涵蓋其全部抗凝活性,如Ⅱ?Ⅶ?Ⅸ等因子的活性?此外,部分醫生誤把Ⅹ因子活性檢測誤認為抗Ⅹa活性定量來申請,也提示加強宣傳溝通的必要性?

抗Ⅹa活性和抗Ⅱa活性分析有助於臨床調整血漿DOACs的有效劑量,但是劑量與療效之間還有多個重要環節;如不同患者體內同等活性劑量水平抑制凝血酶的程度不一,最終將表現為療效差異,故凝血酶生成是關係抗凝治療成敗的關鍵環節?

Ⅹa直接抑製劑和Ⅱa直接抑製劑分別以Ⅹa因子和Ⅱa因子活性部位為作用靶點,最終都減弱了凝血酶的生成?因此,凝血酶生成試驗(thrombin generation test,TGT)可能是反映DOACs抗凝效果的理想手段,需注意,其評估效果存在部分爭議^[21-22],主要原因是半自動方法缺乏標準化以及研究方法的差異,這種缺乏共識的局面有待全自動分析儀上市後得到改善?考慮到血栓形成僅需極少量凝血酶的參與,以nMol數量級表達的凝血酶生成量遠比以「秒」為單位表達的血漿凝固時間要靈敏得多?此外,無論是抗Ⅹa活性還是dTT,反映的都是個別凝血因子的抑制情況,不是總體抗凝效果,凝血酶生成試驗則通過血液凝固速度與強度來反映總體趨勢,因此可能更加客觀和接近體內效應?

血液中半衰期很短的凝血酶-抗凝血酶複合物(thrombin-antithrombin,TAT)可以間接評估藥物抑制凝血酶活化的程度?在全髖關節置換術(total hip replacement,THR)和全膝關節置換術(total knee replacement,TKR)中,凝血酶生成試驗?TAT?凝血酶原片段1+2(F₁₊₂)和D-二聚體顯著增加^[23],只不過存在時序差異而已,THR時F₁₊₂?TAT和DD在新股骨材料植入時達到峰值水平,而TKR則在止血帶解開之後?實際上,代表著凝血酶原活化?凝血酶生成和纖維蛋白降解的三個指標在抗凝治療時反應不是同步的;服用達比加群酯後F₁₊₂沒有顯著變化,D-二聚體有降低但仍處於高值水平,TAT降低後仍高於初始水平,這種差別具有重要提示意義:個體的凝血功能受到藥物抑制時,仍有部分凝血酶原未被完全阻斷,形成了少量的凝血酶維持著最低凝集能力,同時也有繼續形成栓塞的可能?因此,凝血酶生成量的多寡是栓塞風險大小的關鍵,隨著研究的持續深入,期待未來有望發現用於預防血栓的臨界值?

2000年以來,止血-血栓學檢驗發展的重要內容之一是D-二聚體的普及應用?在歷經了特殊患者高陽性率?表達單位差異?如何建立年齡或孕齡分級臨界值和危急值等爭議之後,初步達成了一些共識?此外,纖維蛋白單體(fibrin monomer,FM)檢測從基礎研究進入臨床應用領域則進一步提高了纖維蛋白相關標誌物的臨床價值?

凝血酶生成後,催化纖維蛋白原裂解掉纖維蛋白肽,剩餘片段形成FM,FM在一定程度上反映了凝血酶生成或者說凝集啟動?從過程上講,FM的出現不僅早於D-二聚體,理論上在未形成可檢出的FDP之前即形成FM,在彌散性血管內凝血(DIC)?深靜脈血栓和肺栓塞以及術後顯著增高,因此具有潛在的血栓預警優勢?值得注意的是,圍手術期FM的改變不同於長時間居高不下的D-二聚體和FDP,它表現為創傷或術後FM迅速降至參考區間以內,提示外部損傷停止後血液凝固趨勢的減弱,這種迥然不同的變化趨勢為術後血栓的預後評估提供手段?在利用D-二聚體和FDP判斷纖溶活性和凝塊降解的同時,FM可幫助醫生得以評估抗凝治療中凝血酶被部分抑制後的剩餘活性裂解纖維蛋白原的能力,或了解患者術後是否仍存在血栓形成趨勢^[24]?

FM及其複合物不具備止血能力,需要活化的ⅩⅢ因子(FⅩⅢa)和鈣才能發揮作用,FⅩⅢ通過血小板膜上GPIIb/Ⅲa受體與之結合併在Ca²⁺的參與下使可溶性纖維蛋白複合物交聯,增強對纖溶的抵抗, 發揮穩定凝塊的作用?FⅩⅢ在凝血中所處的關鍵環節,決定著它在血栓形成或損傷出血中重要作用?FⅩⅢ重度缺乏者多有顯著的出血傾向,值得注意的是,原因不明的術中凝血障礙並出血者圍手術期FⅩⅢ顯著低下,即使FⅩⅢ達到60%術後出血傾向仍然較強?傳統的凝塊溶解試驗僅適於檢出重度FⅩⅢ缺乏,輕中度缺陷則需要通過免疫比濁法ⅩⅢ活性定量加以評估?

包括PT?APTT?Fbg、PLT計數和PLT功能試驗在內的傳統出血篩查適於檢出先天性或獲得性血友病等出血性疾病,不能反映FⅩⅢ活性減低^[25]?術前凝血功能篩查正常的患者可能出現術後創面滲血?止血延遲?反覆出血或血腫,即使進行一般凝血因子活性分析也難以發現問題,有必要考慮FⅩⅢ低下的可能,特別是腫瘤患者接受手術或抗凝治療後的意外出血?

抗凝藥物的靶向性要求療效監測的特異性,對現有檢驗手段提出了新的挑戰;討論血栓或出血的靶向監測,並非因新型藥物而起,也並非由功能靶點而延伸,而是創新技術將既往基礎研究的方法轉化為臨床應用,為診斷和治療監測帶來機遇?新型藥物監測手段的出現不僅彌補了傳統實驗室監測的空白,而且將診斷水平帶入了一個監測目標明確?藥物療效可控的新時代?

（參考文獻略）