循環腫瘤細胞和循環腫瘤DNA在前列腺癌個體化治療中的應用

06-05

編者按

　　循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)即由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞，被認為是腫瘤侵襲的標誌物。CTCs作為無創實時腫瘤檢測指標，其在外周血中的數量與多種惡性腫瘤的預後相關。前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)是前列腺癌診療過程中最常用的標記物，但並不是特異性的標記物，CTCs是否可以作為PSA的替代物之一在前列腺癌的診療中發揮作用值得探討。本刊特邀上海復旦大學附屬腫瘤醫院泌尿外科戴波教授對此進行了深入解讀。

液態活檢——循環腫瘤細胞計數

　　前列腺癌特異抗原在臨床應用中其敏感度和特異性存在一定的局限性，所以早期準確診斷前列腺癌仍需更加精準的標誌物。同時，對於轉移性前列腺癌（metastatic prostate cancer, mPCa）、去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)等進行預後的判斷、治療療效的實時定量監測仍是臨床上需要改善的問題。作為指導前列腺癌個體化診療的一種新手段，「循環腫瘤細胞（circulating tumor cells ,CTCs）和循環腫瘤DNA（circulating tumour DNA,ctDNA）」能夠為早期診斷前列腺癌、實時監測轉移性前列腺癌的療效提供更有效的臨床證據。目前臨床常用的主要是CTCs和ctDNA，已有較多研究探索了CTCs和ctDNA在前列腺癌診療過程中的應用前景。其中，美國FDA相繼在2004~2008年間批准外周血CTCs計數可用於轉移性乳腺癌，結直腸癌和前列腺癌的預後評估和治療反應情況的評估。

CTCs的概念及生物學特徵

　　Ashworth於1896 年首次發現並提出CTCs的概念。1889年Paget提出了著名的「種子和土壤」假說（seed and soil hypothesis），該假說中的「種子」即是CTCs，其在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用，此學說成功地闡釋了癌症複發和轉移的機理。腫瘤原發灶或者轉移灶中，具有轉移傾向一類腫瘤細胞，通過上皮間質轉化等生物學行為，遷移入血後，稱之為CTCs，其可分為具有幹細胞特徵的CTCs和不具有幹細胞特徵的CTCs。CTCs一旦遷徙入血，其存活時間一般較短，通常不會超過24h，CTCs在外周血中的存在依賴於細胞複製和凋亡之間的平衡。

　　外周血中檢測出CTC並不一定意味著患者已經存在遠處轉移，具有幹細胞特徵的播散的腫瘤細胞（disseminated tumor cells, DTCs）聚集成團，並且形成微轉移灶，同時該轉移灶可以逃避免疫系統的識別，腫瘤的遠處轉移才可能發生。在腫瘤的浸潤和轉移過程中，腫瘤細胞發生上皮-間葉轉換（epithelial mesenchymal transition, EMT），從而使其更容易侵入血管內皮而進入血循環。同時，標記物角蛋白（cytokeratin, CK）、上皮細胞粘附分子（EpCAM）和波形蛋白的表達水平也發生了變化。理論上講，腫瘤大小超過2 mm左右時便可誘導血管生成進入腫瘤，Husemann等通過動物研究證實在小鼠的早期腫瘤階段，外周血中可以檢測到CTCs，而且隨著腫瘤逐漸增大，CTCs的數量呈指數級別上升。

　　基於CTCs的生物學特徵，CTCs的檢測可有效地應用於腫瘤的體外早期診斷，指導腫瘤的個體化治療。另一方面通過對CTCs的進一步分析，亦可用於檢測惡性腫瘤的分子表達譜從而指導臨床治療或者探索腫瘤在發生髮展過程中的分子生物學行為。

CTCs的檢測方法進展

　　由於CTCs在外周血中的數量很少，每105-107個有核細胞中才有一個CTCs，因此對 CTCs的檢測技術要求更為準確、敏感。CTCs的檢測方法主要分為兩部分：CTC富集技術和CTC檢測技術。其中一種富集、檢測方法如下示意圖:

CTCs在前列腺癌中的臨床應用

　　輔助診斷既往文獻已報道CTCs檢測可用於乳腺癌、結直腸癌、膀胱癌篩查和診斷。Schwarzenbach等入組了69例前列腺癌患者，結果發現71% M0期、92% M1期患者外周血內分別檢測出1-40個CTCs，且CTCs的出現與腫瘤分期（P＜0.03）及增高的Gleason評分（P＜0.04）具有相關性，提示CTCs檢測可協同PSA指導前列腺癌患者預後分期分組。

　　CTCs與前列腺癌分期分級關聯尚有爭議。另一項研究結果顯示，在局限性前列腺癌患者中，CTCs數量與腫瘤大小、病理分期以及Gleason評分不相關。基於CTCs的生物學特徵，在腫瘤早期即有腫瘤細胞進入血循環。因此，檢測CTCs是否有助於前列腺癌的早期診斷仍待大規模的臨床研究。

　　預後判斷和療效評估目前的研究顯示，CTCs數目和腫瘤的進展、接受藥物治療後的療效密切相關。Bono等研究入組了276 例CRPC患者，利用CellSearch平台在治療前後按月對患者外周血CTCs進行持續動態監測，研究發現以CTCs 5個/7.5 ml為Cutoff值，治療前的CTCs基線水平對患者的中位OS具有預測價值，這項研究直接促使FDA 批准CellSearch System(CSS) 用於前列腺癌患者外周血中CTC的檢測。Goodman等研究對33例mHRPC患者內分泌治療前及內分泌治療2個月後進行CTC計數及血生化指標的檢測，統計學結果顯示多因素分析中僅基線CTC計數為mHRPC患者進展至CRPC的獨立預後因素。後續更多學者對發生轉移的前列腺癌患者進行多變數分析，證實CTCs對判斷前列腺癌患者預後生存具有重要價值，其可以作為判斷患者OS以及PFS的獨立預測因子。

　　Okegawa等對80例接受內分泌治療的轉移性前列腺癌患者的CTCs進行了研究，44例（55%）檢出≥5個（7.5 ml外周血），其內分泌治療中位有效期為17個月；小於5個的患者的內分泌治療中位有效期大於32個月。Goldkorn等運用多西他賽聯合醋酸潑尼松治療mCRPC患者的過程中，上升的CTC與OS呈現明顯負相關（HR=2.55）。Stott等使用CTC-Chip技術對19例局限性前列腺癌患者外周血進行CTCs 計數研究，8例患者檢測到CTCs，術後24 h再次檢測，8例患者中6例CTCs計數明顯下降，另外2例患者在術後3個月內也明顯下降，術後1年內均未檢測到複發。

　　大量研究已經證實CTC計數為前列腺癌患者的敏感預後因子和治療療效評估的指標。但是，在CTC的臨床應用中仍存在一些問題，例如對於CTC預測預後的最佳臨界值仍有爭議，CTC在低腫瘤負擔的晚期前列腺癌患者中的預測價值有待進一步評估。

　　此外，CTCs的檢測已經作為一種預後標記物被納入研發前列腺癌的新型靶向治療藥物的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中，其中有項關於阿比特龍治療去勢抵抗性前列腺癌的Ⅱ期試驗，該試驗顯示，60%～70%的患者初始CTCs較高，經過阿比特龍治療後，近一半患者的CTCs降到較低水平。這些研究充分證明了CTCs可作為反映抗腫瘤治療療效的指標，其在臨床新型治療方法的研發中具有重要作用。這為優化治療方案提供了早期依據。

　　CTCs分子標誌物檢測由於在前列腺癌疾病進展過程中，促進腫瘤發展的分子標誌物可能會發生變化。為了實現有效的個體化治療，根據腫瘤所表達分子特徵選擇治療方案至關重要。

　　國外學者研究發現前列腺癌患者CTC中TMPRSS2-ERG基因融合、雄激素受體（AR）突變及雄激素受體剪切變異體-7（AR-V7）突變，往往提示前列腺癌更具侵襲性及對恩雜魯胺和阿比特龍耐葯。其他CTCs水平分子特徵分析的內容還包括PTEN缺失、擴增和MYC的擴增，CTCs中Ki-67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易發生去勢抵抗，AR蛋白的改變與臨床對多西他賽的反應相關，還有對CTCs細胞的微管束研究也發現其與多西他賽化療的療效相關。因此，檢測CRPC患者外周血CTC中AR的亞細胞水平可以預測患者對多西他賽、阿比特龍的反應，對治療方案的選擇和更換具有重要意義。

　　國內復旦大學附屬腫瘤醫院泌尿外科團隊收集了70例mCRPC患者和20例健康人的外周血標本，利用CellSearch方法完成CTC的計數，利用Taqman探針的Realtime-PCR方法完成對CTC的幹細胞標記物檢測。結果發現聯合應用CTC計數和幹細胞標記物檢測的方法，可以比單用計數法，更好的預測mCRPC患者的預後。CTC中幹細胞標記物表達陽性的患者相比陰性患者，前者對多西他賽聯合強的松治療的療效較差。

ctDNA的概念及生物學特徵

　　血漿遊離DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中遊離存在、不包含在完整細胞結構內的DNA。循環腫瘤DNA(circulating tumor, ctDNA)來源於腫瘤細胞的cfDNA，屬於cfDNA的一種類型，主要存在於血液、滑膜液和腦脊液等液體中，可經尿液和糞便排出，含量極微。通過對cfDNA中腫瘤特異性的畸變（如腫瘤原癌基因和致癌基因突變、微衛星改變和DNA甲基化等)的識別，證實其為腫瘤細胞來源的cfDNA，且與腫瘤細胞基因組信息相一致。ctDNA主要來源於：①來自於壞死的腫瘤細胞；②來自於凋亡的腫瘤細胞；③CTC；④來自於腫瘤細胞分泌的外排體。

　　作為cfDNA中的一類，來源於腫瘤細胞的ctDNA攜帶有腫瘤患者的基因信息，可以間接反映腫瘤疾病的相關特徵，定量或定性分析這些循環 DNA 對腫瘤的早期診斷、個體化治療、病情監測及預後的評價都具有重要意義。

ctDNA的檢測方法進展

　　同CTC檢測一樣，建立有效、可靠的標準化ctDNA檢測方法是將其應用於臨床的必要前提。對cfDNA的檢測可分為定量和定性兩種：前者主要檢測血清和血漿的DNA總量血，後者則檢測清和血漿中腫瘤特異性基因的改變。對於定量檢測，既往缺乏統一標準，再加上操作技術的限制，導致其定量檢測一直未收重視。隨著放射免疫分析和對流免疫電泳技術的發展，DNA檢測靈敏度有了較大的提高，可以檢測納克級(ng)的DNA。ctDNA 的定性分析是指對腫瘤特異性基因改變的檢測。理論上，任何腫瘤相關的遺傳學和表遺傳學改變均可以用來進行檢測。而目前臨床上，主要開展的檢測包括基因突變、甲基化異常、微衛星不穩定性和雜合性缺失等。

　　ctDNA在腫瘤疾病(甚至進展期)的含量都是非常稀少的，與cfDNA的含量相比甚至<0.01%。因此，上述常規檢測手段不一定能有效的從cfDNA中區別目標ctDNA並加以檢測。二代測序技術的發展則使ctDNA中腫瘤特異性的基因突變或是拷貝數異常的檢測成為可能。而且這種高通量的方式具有非常高的敏感性，並能精確的捕捉到臨床治療過程中微量ctDNA的變化。

ctDNA在前列腺癌中的臨床應用

　　目前關於惡性腫瘤診斷的研究聚焦於患者ctDNA含量與正常人之間的差異。多項研究相繼證實，在結腸癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤患者外周血中的ctDNA含量與正常人存在明顯差異。針對前列腺癌，Altimari等在2008年的一項研究顯示，臨床局限型前列腺癌患者（64例）的cfDNA水平(15.4±0.9 ng/mL)明顯高於健康男性（45%）的cfDNA(5.5±3.5 ng/mL)（P<0.001），其敏感度和特異度分別達到了82%和80%，並且血漿遊離DNA水平還和前列腺癌分期相關，T3期的前列腺癌患者其cfDNA水平明顯高於T2期者(17.5 ±12.1 vs 12.6 ± 8.4 ng/mL; P＜0.05)。目前有關cfDNA應用於前列腺癌診斷的研究數據尚少，但這些研究視野的拓展和新發現，為腫瘤的早發現、早診斷提供了新的思路和方法。

　　近年來，有關cfDNA水平變化與抗腫瘤（包括手術、放療、新輔助化療、姑息性化療等）療效預測方面的研究陸續出現。Kienel等入組了59例前列腺癌患者，其中48例（81.4%）接受多西他賽化療的CRPC患者的cfDNA下降水平和PSA下降幅度呈負相關，而在評價生存期方面，基線cfDNA≥55 ng/ml（5例）和＜55 ng/ml的PFS分別為9.4和7.5月，OS分別為17.0和31.5月。

　　上述一系列研究主要從cfDNA的整體水平變化進行探討，針對與疾病關係明確的DNA片段進行定性分析可為腫瘤個體化治療提供實驗依據。Lallous等通過對CRPC患者外周血cfDNA進行基因組定性分析，以ctDNA中檢測到的AR BF3位點為靶點的恩雜魯胺在CRPC患者中可有效阻礙其他所有24個AR突變的活性。通過對cfDNA中的ctDNA進行定性，進而進行基因分析可為CRPC患者提供更精準的治療。對前列腺癌中ctDNA進行定性分析的研究尚屬少數，探索ctDNA在前列腺癌中應用仍需更多、更大規模的研究。

　　ctDNA可以直接從患者的外周血中獲取，有望發展成為一種新型的腫瘤學監測指標。作為一種靈敏、特異、無創的分子生物學檢測手段，檢測ctDNA可以便捷地對腫瘤做出早期診斷、進行療效監測及對惡性腫瘤做出預後評價，可應用於腫瘤的預防以及個體化治療的開展。

結語

　　CTC和ctDNA還有很多問題值得去探索，富集、檢測技術的改進，輔助前列腺癌診斷、預後判斷及療效監測都需要進一步、大規模的臨床數據證實。

專家簡介

戴波：主任醫師，副教授，碩士生導師，醫學博士，上海復旦大學附屬腫瘤醫院泌尿外科副主任。中國抗癌協會泌尿男生殖系腫瘤專業委員會青年委員會副主任委員；上海市泌尿外科學會青年委員。

長期從事泌尿系統腫瘤的臨床診治與基礎研究工作，在國內外一流學術刊物上以第一作者或通訊作者發表科學論文50餘篇，其中SCI收錄論文24篇。先後被評為：復旦大學十大醫務青年、上海市衛生系統優秀青年人才、仁心醫者（上海市傑出專科醫師獎提名獎）。當前主要研究方向包括：泌尿系統腫瘤的複發和轉移機制。前列腺癌的早期診斷策略、多學科綜合治療策略的優化、去勢抵抗性前列腺癌的預後判斷和個體化治療方案的研究。　　

（來源：《腫瘤瞭望》編輯部）

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