腸道菌群助力腫瘤免疫治療：共生雙歧桿菌提高抗腫瘤免疫力，促進抗PD-L1腫瘤免疫療法的效果

導讀

癌症的傳統治療方式，包括手術、放療、化療、靶向治療，均具有不同的局限性。手術對於腫瘤未轉移患者來說是首選的治療方式，能直接將肉眼所見的腫瘤組織切除，但對於轉移性患者手術治療無能為力。放化療能大面積多點殺傷腫瘤細胞，但同時亦可傷及正常組織細胞，產生程度不同的不良反應。靶向藥物治療效果明顯，見效快，但腫瘤細胞很快就產生耐葯。因此，傳統的治療方式不但面臨各種副作用，同時也無法防止腫瘤複發。而腫瘤免疫治療則不同，它是通過增強患者自身免疫力來治療腫瘤，具有反應快、副作用小療效持久的特點。腫瘤免疫治療被認為是近幾年來癌症治療領域最成功的方法之一。

腫瘤免疫治療主要分為兩大類：

1.細胞免疫療法。細胞免疫療法是提取患者體內的免疫細胞，在體外進行改造，使其具備對癌細胞更有效、更精準的免疫能力，再將改造後的免疫細胞回輸到患者體內。例如TCR-T、CAR-T等療法。

2.免疫檢查點抑製劑療法。癌細胞會發送信號利用免疫細胞上的免疫檢查點分子來抑制免疫細胞的活性，逃脫免疫系統的殺傷。而免疫檢查點抑製劑如CTLA-4抗體和PD-1/PD-L1抗體則可抑制免疫檢查點(Figure1)，激發免疫系統原有的抗癌能力。免疫檢查點抑製劑療法已成為目前國際上腫瘤免疫治療的主要研究方向。

Fig.1.抗CTLA-4和抗PD-1免疫檢查點抑製劑靶向不同的腫瘤浸潤T細胞以抗癌。

但是只有25%的病人對免疫檢查點抑製劑療法有應答。2015年的兩篇動物實驗文章表明，改變小鼠的腸道菌群能夠使其對免疫檢查點抑製劑療法具有更好的應答。這個研究結果極大地鼓舞了研究者，但也有研究者對此抱有懷疑，這只是小鼠中取得的成果，需要在人體中進行研究才行。最近發表在《Science》上的兩篇文章則證明，腸道菌群的確會影響免疫檢查點抑製劑療法的抗癌療效。

Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitatesanti–PD-L1 efficacy

共生雙歧桿菌提高抗腫瘤免疫力，促進抗PD-L1腫瘤免疫療法的效果

文獻ID

期刊：SCIENCE

年份：2015

影響因子：38.062

作者：ThomasF. Gajewski

發表單位：Universityof Chicago

主要內容

1. 實體瘤的T細胞浸潤與患者良好的預後相關，但個體間免疫應答的效應不同，其中的機制尚不清楚。一種可能的調節因子是腸道菌群。

2. 研究者比較了具有不同共生菌群的小鼠的黑素瘤的生長情況，發現小鼠自發性抗腫瘤免疫力有所差異，而這些差異在共同飼養或糞菌移植後被消除。

3. 通過16SrRNA測序鑒定出雙歧桿菌與抗腫瘤效應相關。口服雙歧桿菌與抗PD-L1治療的療效類似，二者聯合治療幾乎能終止腫瘤的生長。

4. 該效應中，樹突細胞功能增強，導致CD8 T細胞功能的增強，並在腫瘤微環境中積聚。該研究表明，改變菌群可能會調節癌症免疫治療的效果。

關鍵詞：菌群；癌症；黑色素瘤；PD-L1抗體；免疫檢查點抑製劑；雙歧桿菌；樹突細胞；T細胞；

研究背景

2013年Lida和Viaud等人研究發現，腸道菌群能調節機體對化療藥物的免疫應答。但是共生菌群是否影響機體的自發性抗癌免疫應答，從而影響免疫檢查點抑製劑如抗–PD-1/PD-L1單克隆抗體的療效，至今仍不清楚，這也是本文所要解答的科學問題。

主要內容

1JAX和TAC小鼠的黑色素瘤生長和腫瘤特異性免疫反應有差異，且共同飼養後這種差異消失

為了回答背景中的科學問題，研究者利用遺產上相似、但來源於兩個不同的動物中心（JAX和TAC）且共生菌群不同的C57BL/6小鼠，比較其B16.SIY黑色素瘤的生長情況。發現TAC小鼠中黑色素瘤的生長更迅猛(Fig.1A)，且JAX小鼠中腫瘤特異性T細胞反應(Fig.1B，C)和腫瘤內CD8 T細胞的累積(Fig.1D)要顯著高於TAC小鼠，這表明小鼠中黑色素瘤的生長的差異是由免疫介導的。

這種免疫效力上的差異是否與共生菌群有關？在腫瘤定植之前，研究者將JAX和TAC小鼠放到同一環境中飼養，發現「cohousing」能夠消除兩種小鼠腫瘤生長上的差異(Fig.1E)和免疫應答的差異(Fig.1, F-H)，表明：環境因素在其中發揮作用，且JAX小鼠的共生菌群可能具有促進抗癌免疫的能力。

Fig.1. Differences inmelanoma outgrowth and tumor-specific immune responses betweenC57BL/6 JAX and TAC mice are eliminated upon cohousing.

2TAC小鼠口服JAX小鼠的糞便可增強其自發性抗癌免疫，以及對αPD-L1mAb治療的應答

為了更加直接地驗證共生菌群在抗癌免疫調節中的作用，在腫瘤移植之前，研究者將TAC或JAX小鼠的糞便懸液以口服的方式填喂JAX和TAC小鼠。發現與生理鹽水和TAC糞便相比，JAX糞便足以抑制TAC小鼠的腫瘤生長(Fig.2A)，增強腫瘤特異性CD8 T細胞的浸潤和誘導(Fig.2B，C)。而TAC糞便飼養對JAX小鼠的腫瘤生長速率和抗癌T細胞活性的改變則很小(Fig.2, A-C)。與第一個實驗的結果一致：共飼養時JAX小鼠的菌群具有優勢效應。

Fig.2. Oral administrationof JAX fecal material to TAC mice enhances spontaneous antitumorimmunity and response to αPD-L1 mAb therapy.

3TAC小鼠經雙歧桿菌處理後，其腫瘤特異性免疫反應和對αPD-L1mAb治療的應答都得到改善

既然口服菌群能夠改善小鼠的抗癌免疫力，那麼改變腸道菌群與已有的免疫治療手段相比效果如何？研究者採用以下三種方法治療TAC腫瘤小鼠：①JAX糞便單獨治療；②PD-L1抗體(αPD-L1)單獨治療；③JAX糞便與αPD-L1聯合治療。發現JAX糞便單獨就可以顯著減慢腫瘤生長並增強腫瘤特異性T細胞反應和抗原特異性T細胞在腫瘤中的浸潤(Fig.2, D-F)，與αPD-L1單克隆抗體(mAb)的療效相同。聯合使用JAX糞便和αPD-L1mAb的效果更好，但腫瘤微環境中活性T細胞的積累並沒有加和效應(Fig.2, D-F)。表明共生菌群確實能夠影響小鼠的自發抗癌免疫力以及對αPD-L1mAb免疫治療的應答。

那麼與抗癌免疫力的改善相關的細菌具體是哪種？研究者利用16SrRNA測序追蹤接受了糞便治療的小鼠的糞便菌群隨著時間的變化情況。通過主坐標分析可看出，隨著時間的推移，接受了JAX糞便的TAC小鼠的菌群逐漸與接受安慰劑和TAC糞便的TAC小鼠分離開來，且更接近接受了安慰劑和JAX糞便的JAX小鼠的菌群(Fig.3A)；接受了TAC糞便的JAX小鼠的菌群多樣性有顯著改變，但其菌群改變的距離很小(Fig.3A)。

通過JAX小鼠和TAC小鼠在屬水平上的比較分析，得到257個相對丰度有顯著差異的taxta(Fig.3B)，但只有Bifidobacterium（雙歧桿菌）與抗癌T細胞反應顯著正相關，其相對丰度在餵食了JAX糞便的TAC小鼠中增加了400倍以上(Fig.3C)。因此可以假設，雙歧桿菌是JAX小鼠中觀察到的有益抗癌免疫力的主要組分。

Fig.3. Directadministration of Bifidobacterium to TAC recipients with establishedtumors improves tumor-specific immunity and response to αPD-L1mAb therapy.

在序列水平上，雙歧桿菌的操作分類單元OTU_681370與抗癌T細胞應答的相關性最強(Fig.3D)。進一步鑒定發現該OTU與B.breve，B.longum和B.adolescentis的一致性達到了99%。利用商業性的雙歧桿菌混合物（包括B.breve和B.longum）治療患癌TAC小鼠，證明雙歧桿菌足以增強抗癌免疫力。經雙歧桿菌治療的小鼠的腫瘤生長得到了很好的控制(Fig.3E)，外周血中腫瘤特異性T細胞的誘導增強(Fig.3F)，腫瘤內抗原特異性CD8 T細胞的積累增加(Fig.3G)，而且這些效應可以持續幾周的時間。

進一步探究雙歧桿菌發揮療效的條件。刪除CD8T細胞後該菌的療效消失，表明雙歧桿菌是通過宿主的抗癌T細胞反應發揮療效，而不是直接起作用；滅活後的雙歧桿菌也沒有療效，表明抗癌效應需要活菌；而且其它相對丰度有顯著差異的taxta（如Lactobacillusmurinus）並沒有抗癌療效，表明抗癌免疫的調控有賴於特定的細菌。另外，雙歧桿菌還可以抑制B16親本腫瘤細胞和MB49膀胱癌細胞的腫瘤生長。總之，雙歧桿菌是體內抗癌免疫的正向調控因子。

接種雙歧桿菌後，有一小部分菌種會隨之發生變化（如Clostridiales和產丁酸鹽菌減少，會導致調節性T細胞受到抑制），有沒有可能雙歧桿菌主要是通過調控其它細菌的丰度來發揮作用的？研究者觀察到這些細菌的變化與JAX糞便處理後的變化並不一致，而且JAX和TAC小鼠的CD4 Foxp3 T細胞（調節性T細胞）並沒有差異，因此可以判斷雙歧桿菌並不是主要通過調控其它細菌的丰度來發揮作用的。經檢測發現雙歧桿菌填喂後並沒有移位到腸系膜淋巴結、脾臟或腫瘤等部位，表明所觀察到的系統性免疫效應與雙歧桿菌移位無關。

4JAX和雙歧桿菌餵養的TAC小鼠的樹突細胞中，與抗癌免疫和T細胞活化有關的基因表達增加

上述實驗研究已經比較縝密地證明了雙歧桿菌的抗癌作用，這背後的免疫學機制就成了擺在我們面前最大的問題。JAX小鼠和經雙歧桿菌治療的TAC小鼠的腫瘤引流淋巴結中CD8 SIY-specific 2C TCRTg T cells數量極大的擴增，且產生了大量的IFN-γ(Fig.4A)。表明T細胞上游的樹突細胞（DCs）免疫反應有所改善，與此相一致的是JAX小鼠和經雙歧桿菌治療的TAC小鼠腫瘤中MHCClass II^hiDCs的比例增加(Fig.4B)。

研究TAC小鼠、JAX小鼠和經雙歧桿菌治療的TAC小鼠中早期腫瘤浸潤性DCs的全基因組轉錄情況。JAX小鼠和經雙歧桿菌治療的TAC小鼠的DCs中760個基因的表達上調，顯著富集在細胞因子—細胞因子受體相互作用、T細胞活化和單核細胞增殖的正向調控通路中(Fig.4C)，其中許多基因參與CD8 T細胞的激活和共刺激(H2-m2,Cd40, Cd70, Icam1)，DC成熟(Relb,Ifngr2)，抗原遞呈和交叉遞呈(Tapbp,Rab27a, Slc11a1)，趨化因子介導的免疫細胞在腫瘤微環境中的富集(Cxcl9,Cx3cl1, Cxcr4)，1型干擾素信號通路(Irf1,Ifnar2, Oas2, Ifi35, Ifitm1) (Fig. 4D)。

那麼TAC、JAX和雙歧桿菌治療的TAC小鼠中DCs的功能差異是否足以解釋體內T細胞活化的差異？研究者從這三種幼鼠中分離DCs，檢測其在體外誘導CFSE-labeledCD8 SIY-specific 2C TCR Tg Tcell增殖和IFN-γ產生的能力。發現與TAC小鼠相比，來自JAX和雙歧桿菌治療的TAC小鼠的DCs在較低的抗原濃度下就能誘導2CT細胞增殖。而且在任何抗原濃度下，JAX的DCs都能提升T細胞產生IFN-γ的水平(Fig.4E)。

總之，以上研究結果表明，共生雙歧桿菌產生的信號能夠穩定地調節DCs的活化，從而改善腫瘤特異性CD8 T細胞的效應功能。

Fig.4. Dendritic cellsisolated from JAX and Bifidobacterium-fed TAC mice show increasedexpression of genes associated with antitumor immunity and heightenedcapability for T cell activation.

小結

1.該研究證明了雙歧桿菌以一種抗原非依賴性方式改善體內的抗癌免疫效應。

2.該研究表明造成個體間抗PD-1/PD-L1抗體抗癌療效的差異的原因之一是腸道菌群的組成，可改變腸道菌群來改善治療效果。

3.可進一步研究腸道菌群與其它免疫檢查點抑製劑（CTLA-4）的療效之間的關聯。

4.該研究並沒有完全排除其它共生細菌調節抗癌免疫效應的能力。

文獻來源：