CRISPR–Cas9 五大謎底

CRISPR雖然作為基因編輯工具，現在已經成為生物醫學領域的最熱門技術，研究該技術的幾個科學家也一定會毫無懸念獲得諾貝爾獎。但是這種技術源頭本身，目前仍然存在一些重要科學問題沒有被解釋，解釋這些問題也具有重要學術價值。

FranciscoMojica不是最早研究CRISPR現象的學者，但他可能是最早對CRISPR著迷的學者，言外之意是他意識到這個系統的重要性。1992年的一天，他了解到這個微生物免疫系統。當對一種嗜鹽菌（Haloferax mediterranei）基因組序列進行分析時，他注意到14個異常DNA序列，這些序列長度都是30個鹼基。序列特徵類似迴文結構，每間隔35個鹼基再重複一次。不久他找到更多類似重複結構。他對這種現象十分著迷，在西班牙阿利坎特大學對這個現象進行了反覆研究。

但是當時對這個現象的研究非常不時髦， Mojica的實驗室多年拿不到研究經費。他利用學術會議等機會請教學界大佬們，諮詢對這種重複序列的看法，但這些人都提醒他不要沉溺於這種重複序列，重複序列在許多物種都存在，這麼多年來大家都弄不懂它們的作用。言外之意就是這玩意很奇怪，量你弄不明白。因為研究條件和經費限制，Mojica發現CRISPR位點（locus）短序列重複結構後，使用序列比對方法發現重複序列之間的間隔序列其實是病毒和細菌的結合性質粒，揭示了CRISPR是細菌的適應性免疫功能。

今天CRISPR簡直是如雷貫耳，並不是因為這是細菌的免疫系統，而是因為經過改造後的CRISPR–Cas9已經成為最好的基因編輯工具。

不過Mojica們仍考慮這個系統的純科學問題，如這個系統是如何工作的？這個系統是如何進化的？這個系統對微生物進化有沒有影響？為什麼只有一部分微生物使用這個免疫系統？這個系統有沒有其他更基本的生物學功能？

最早使用這個系統進行基因編輯的學者，加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna教授也認為，CRISPR所以受到大家的關注是因為這個技術成為基因編輯工具，其實這個系統本身仍然有許多基本生物學問題沒有解決。

一、CRISPR從哪裡來？

存在CRISPR-Cas系統的優勢顯而易見。細菌和古菌等原核生物一般都生活在極端環境中，經常面對各種遺傳入侵者的攻擊。病毒（噬菌體）數量是原核生物的10倍，據說每兩天可以殺死世界上一半的細菌。原核生物之間也可以交換質粒DNA，這些質粒DNA能在宿主細菌體內寄生，消耗資源，宿主試圖驅逐搭順風車的病毒和質粒，有時候被迫採用自我毀滅的辦法。從土壤、大海，一直到最荒涼的地方，細菌總是無法擺脫病毒和質粒的入侵者。

原核生物進化出了一系列應對這些威脅的武器，例如限制性內切酶可以在特定序列對目標DNA進行切割。但這些防禦工具比較遲鈍，每個酶只能識別特定的序列，微生物必須有正確的序列拷貝才能受到保護。CRISPR-Cas則更加靈活，能記憶特定遺傳入侵者序列並給宿主提供針對入侵者的長期免疫排斥能力。荷蘭瓦赫寧根大學微生物學家約翰·范德東說，第一次聽說這個說法，許多人都認為這過於複雜，不可能是簡單的原核生物使用的免疫工具。

Mojica等根據CRISPR迴文重複序列之間序列有的和病毒基因組序列一致，提出CRISPR–Cas的功能是細菌對抗病毒的免疫系統。隨後科學家證明，一旦細菌暴露於特定病毒或質粒，CRISPR相關蛋白確實能將這些序列插入宿主基因組。這些插入的序列轉錄的RNA可以引導Cas蛋白剪切任何能與這一序列配對的入侵DNA或RNA序列。

細菌和古菌是如何擁有了這樣一套複雜的免疫系統？這個問題至今無法回答，但是主流觀點認為是來自轉座子。轉座子是可以從基因組一個位置到另一個位置的「跳躍基因序列」。美國NIH進化生物學家Eugene Koonin等發現一組這類遺傳序列能編碼Cas1，這種蛋白負責將基因間隔區插入基因組。這些Cas轉座子可能是CRISPR–Cas系統形成的原因。科學家現在正在研究這些序列如何從一個部位向另一個部位轉移，並研究這種轉移如何進化出複雜的CRISPR–Cas系統。

二、細菌CRISPR–Cas系統如何工作

Cas蛋白也就是CRISPR關聯蛋白，負責將病毒間隔子spacers插入細菌基因組，最近幾年對這一過程的分子細節已經了解比較清楚。但是病毒和宿主DNA在化學成分上幾乎完全一致，Cas蛋白是如何記住間隔子序列仍然是個疑問。

立陶宛維爾紐斯大學生物化學家Virginijus Siksnys說，這是個風險係數比較大的功能，假如細菌把自己的DNA誤插入，將會造成自身免疫反應甚至自殺。這一系統是雙刃劍。北卡羅萊納州立大學微生物學家Rodolphe Barrangou認為，在眾多的細菌和古菌中，應該有一些因錯誤把自身序列插入CRISPR，不過用一部分細菌自殺為代價換來耐受病毒的威脅是值得的。高等生物包括人類也有自身免疫疾病，這也是應對外來威脅保存自身的必要犧牲。

當病毒感染了細菌，大約一千萬個被病毒感染的細菌才能獲得一個隔離子，從而獲得對該病毒的免疫力。或者說細菌成功免疫病毒的概率僅有千萬分之一。這種小概率事件給研究帶來比較大的困難，很難弄清楚是什麼讓某些細菌獲得對某種病毒的免疫力。人類如果掌握了細菌免疫病毒的工作原理，也許可以按照同樣的策略治療病毒感染。這是研究這種現象的功利性目的。洛克菲勒大學微生物學家Luciano Marraffini說，非常難及時發現某個細菌獲得了這樣的能力。

弄清楚如何識別間隔子，或加快這種編輯速度，都可能是有價值的。研究表明，某些CRISPR-Cas系統作為記錄裝置，可對遇到的DNA和RNA按照序列進行分類。利用這樣的性質，科學家可以示蹤細胞的基因表達，或研究某些化學物質對基因表達的影響。

科學家也希望了解這個系統如何把一些少見的序列忘記或屏蔽。大多數擁有CRISPR–Cas系統的微生物只有數量不多的間隔子，有的只有一個，這些免疫系統只能對一種或幾種病毒進行切割破壞。超嗜熱古菌Sulfolobus tokodaii是個例外，有5套CRISPR–Cas系統，485個間隔子。

繼續保持舊的間隔子可能有某種生物學意義，如果病毒發生變異，可以逃避CRISPR-Cas，使舊的間隔子失去價值，繼續保留這樣的序列對微生物來說是額外負擔。以色列雷霍沃特魏茨曼科學研究所遺傳學家Rotem Sorek說，細菌不可能持續擴張自己的基因組。

三、CRISPR-Cas系統非免疫功能？

間隔子序列理論上來自於病毒，但是大多數這種序列的來源目前不清楚。已知CRISPR序列只有不足3%能與DNA資料庫已知序列匹配，97%以上的序列找不到來源，這說明我們對病毒基因確實非常無知。

首先說明我們對大多數病毒序列不了解。現有測序工作一般集中在人類患者、牲畜或農作物基因組上。雅典大學RNA生物學家Michael Terns說：「我們對細菌和古生菌的敵人，噬菌體知之甚少。」其次是許多序列在病毒中已經消失。當然也有可能是因為某些鬼魂病毒序列，這些序列曾經存在，但為了逃避CRISPR的絞殺而突變進化成其他序列，要知道病毒基因突變是經常發生的。第三種說法最為奇異。科學家發現CRISPR–Cas系統不僅僅是破壞外來入侵基因。一些細菌的CRISPR–Cas元件具有控制DNA修復、基因表達和生物膜形成等功能。也有一些CRISPR–Cas系統是決定感染其他物種的能力。嗜肺性軍團菌能引起軍可入侵團病，這種細菌必須擁有Cas2才能感染到能感染其天然宿主變形蟲。

RNA干擾是植物、動物和非原核生物基因表達沉默系統。RNA干擾也被認為是一種古老的基因入侵防禦系統，隨著生物進化，這種系統被改造成為基因表達調控系統。也可以參考RNA干擾這樣理解CRISPR–Cas系統，細菌抓捕病毒基因序列也是補充自身基因組的一種方式。獲得任何新序列也等價於獲得一些新功能，這難道不就是進化的本質嗎？也許複雜高等生物就是這樣進化來的。CRISPR–Cas系統是一種基因獵捕工具。按照基因自私的邏輯，CRISPR–Cas系統為基因的廣泛傳播提供了跨物種的途徑。

四、為什麼不是所有微生物都使用CRISPR-Cas系統？

一些微生物體內存在大量CRISPR-Cas序列和蛋白，另外一些比較少，也有的微生物沒有這個系統。90％的古細菌具有CRISPR的免疫系統，大約1/3已知細菌細胞內存在這個系統。為什麼CRISPR-Cas系統在不同微生物存在如此大的區別？

關於CRISPR-Cas系統目前發現最奇特的一種古菌是納米古菌Nanoarchaeum equitans，這種寄生古菌自身缺乏許多與能量產生和表達調控相關的基因，只能寄生於另一種沸水古細菌細胞內。僅有49萬個鹼基對組成的微小基因組中，竟然擁有約30個CRISPR-Cas系統。

根據數學模型和一些初步的實驗研究，如果CRISPR–Cas只有4-5個類型的病毒序列，這種系統只能在細菌基因組記錄有限數量的病毒序列。如果病毒序列發生廣泛突變，CRISPR–Cas系統無法有效避免病毒的入侵。另外一種解釋是，生活在極端條件下的古菌無法使用其他防禦系統。細菌對抗外來入侵的方法是把突變蛋白包裹起來，但是這需要消耗比較多的能量，這對古菌這種物種來說具有很大挑戰性。使用CRISPR系統則相對比較輕鬆。

五、究竟存在多少種CRISPR-Cas系統？

科學家熱衷於研究CRISPR-Cas9系統，是因為基因組編輯作為一種技術，簡單性和多功能性的CRISPR-Cas9系統受到更多科學家的熱愛。簡單是容易操作容易被重複，多功能是應用廣泛，這是一個新技術被重視的最重要特徵。但是微生物對Cas9沒有多大興趣，相反細菌更熱愛使用多個CRISPR-Cas系統，這樣才能應對不同的入侵者。存在多種不同的系統使細菌可以從其同伴中獲取新的CRISPR-Cas系統，並迅速丟棄原有的類型。目前已經確定6種不同CRISPR系統，共19個亞型。

揭開這些CRISPR-Cas系統的分子機制可能是尋找新型基因編輯技術的關鍵。CRISPR-Cas9屬於II型系統，利用RNA分子轉錄間隔子序列，引導Cas對入侵基因進行切割。去年發現的VI系統則不是對DNA，而是對RNA進行切割。IV型系統CRISPR-Cas相關基因，但是缺乏重複序列和插入間隔子序列的功能。

存在如此多不同特點，說明存在一些CRISPR–Cas系統進化的關鍵影響因子。必須保證這種系統能破壞病毒入侵的同時避免自身受到傷害。極端環境似乎對特別眷顧CRISPR–Cas系統，這也是為什麼一些科學熱衷於從海底或火山口微生物尋找新的CRISPR–Cas系統。不過CRISPR–Cas系統對細菌生存環境有重要影響。一種鳥類支原體寄生在雞體內有CRISPR–Cas，但寄生在野雀體內沒有這種系統。

III型系統也是自然界最常見的CRISPR–Cas，但是也是研究最少的類型。證據提示這種系統並不對入侵DNA或RNA本身反應，但是能干擾DNA向RNA的轉錄過程。如果這個現象被確認，這個系統可以開發成CRISPR–Cas基因編輯工具的新功能。

也可能會有新的類型被發現，特別重要的是科學家從可培養微生物向不能培養的更多類型的微生物尋找目標，最近Jennifer Doudna剛剛報道的更小分子Cas就是利用這個思路。

Mojica對不同類型的CRISPR系統研究是為了回答基礎科學問題，他沉迷於CRISPR已經1/4個世紀，雖然關於基因編輯的研究經費非常多，但是這並不是他的菜。雖然他也清楚，這個系統對基因更能的研究甚至人類疾病治療都具有巨大應用前景，但是他就是想知道這個系統背後的秘密。