RNA修飾表觀遺傳學的前期探索

06-02

編者按

「一扇大門從此開啟」——作者在本文中詳細回顧了第一個RNA去甲基化酶FTO活性發現之前自己的科研探索。展示了這一突破時點之前實驗室深邃的思考和曲折、細緻的摸索過程。其中作者大量創新運用的嫻熟化學合成技巧和化學生物學技術，從多個角度試探RNA去甲基化酶，細膩緊湊，讓人大呼過癮。

2007年下半年我作為芝加哥大學化學系研究生加入何川教授實驗室，當時實驗室已經在幾個研究方向上頗有建樹，其中的一大方向便是對AlkB家族蛋白的結構和功能的研究。AlkB蛋白最早於E.coli中發現，屬於DNA損傷修復蛋白中的一類，主要負責修復被甲基化損傷的DNA。AlkB蛋白以鐵，氧氣和alpha-酮戊二酸為輔基，通過氧化被損傷的DNA上的甲基來達到去除該甲基的目的。其作用機理為氧化這個甲基上的碳-氫鍵生成羥基，同時若這個甲基是與DNA雜環中的氮原子相連的話，生成的羥甲基不穩定，而會自發以甲醛的形式脫下，從而逆轉DNA上的甲基化損傷。當時在人類的基因組中已經發現了9個與AlkB同源的蛋白，除了ALKBH2確定為雙鏈DNA甲基化修復蛋白，ALKBH3推測為單鏈DNA或可能的RNA甲基化修復蛋白外，其他AlkB同源蛋白的功能尚不清楚。而在我加入實驗室之時，恰逢與肥胖相關的基因FTO對應的蛋白被發現也是AlkB的同源蛋白，並且被報道能催化單鏈DNA上3-甲基胸腺嘧啶 (3-methylthymine, m³T)的去甲基化 (Science, 2007, 318, 1469)。於是我的研究方向便初步確定為FTO的去甲基化活性是如何與肥胖等生物學效應相聯繫的。

在那個時候，對於DNA和組蛋白甲基化對基因表達調控的研究正進行得如火如荼，我們猜測FTO或許會通過與組蛋白去甲基化酶類似的機理對基因表達進行調控，由於當時DNA上的重要表觀遺傳標記5-甲基胞嘧啶 (5mC)的去甲基化酶尚未被發現，我們期望FTO也許能催化5mC的去甲基化，但體外生化實驗表明FTO對於5mC並無任何活性。於是我開始通過一些細胞生物學實驗來尋找可能的線索，我的第一個實驗便是通過過表達和敲低FTO蛋白並使用DNA微陣列晶元分析基因表達的變化，發現近千種基因的mRNA水平發生了變化。同時我也與其他實驗室合作，通過蛋白免疫共沉澱，酵母雙雜交技術，蛋白-蛋白作用陣列等多種手段尋找可能與FTO有相互作用的蛋白。2008年初，我獲得了幾個長長的可能與FTO有直接或者間接相互作用的蛋白的列表，這些列表中無一例外地出現了一些與RNA相作用的蛋白，卻幾乎沒有與DNA相作用的蛋白。與此同時，實驗室另一名成員賈桂芳也在對體外純化的FTO蛋白進行生化活性的檢測，她發現FTO蛋白對於單鏈RNA上3-甲基尿嘧啶 (3-methyluridine, m³U)的去甲基活性要大大高於此前文獻報道的單鏈DNA上的m³T (FEBS Letters, 2008, 582, 3313)。

綜合體內和體外實驗的結果，此時我們開始設想或許FTO對於基因表達的調控是通過去除RNA上的甲基化來實現的。當時RNA上已知的修飾有一百多種，其中光甲基化修飾就有十幾種，但是這些鹼基修飾的性質和生物學功能卻無人知曉，去掉這些甲基化修飾又是如何調控基因表達的就更難以預測了。即便如此，我們設想假如我們真的能夠確定FTO可以在細胞內去除RNA上的某種甲基化修飾，或許能提供一些線索來理解RNA上各種修飾在生物調控過程中的作用，我們已經了解了那麼多DNA和組蛋白修飾的作用，RNA上有著更為豐富的修飾，它們的功能卻一無所知，我們似乎踏進了一片無人開採的處女地，種種猜想開始形成於我們的腦海，令人激動不已。

配圖，引自RNA epigenetics? Chuan He, Nature Chemical Biology, 2010, 6, 263

猜想歸猜想，我們還需要強有力的證據來證明這些猜想中的任何一個。我開始試圖證明在培養的人體細胞系中，RNA上的m³U是否可以成為FTO的底物。哺乳動物的RNA上擁有一百多種經過化學修飾的鹼基，其中大部分卻並不知道具體位置。在近四十年的研究中，rRNA，tRNA和small nuclear RNA (snRNA)上不同鹼基修飾的位點逐漸被確定下來。在對這些已知的RNA修飾位點進行充分分析之後，我了解到在人類細胞中，m³U只在rRNA上的某個特定位點上發生，於是我設計實驗對rRNA上m³U的含量進行定量分析，並且在細胞系中過表達和敲低FTO蛋白並測量rRNA上的m³U丰度是否有所變化。令人失望的是，我的實驗結果表明FTO蛋白並沒有影響rRNA上m³U的丰度。而通過對rRNA三維結構的觀察我發現m³U在rRNA摺疊後位於rRNA的內部，而AlkB家族蛋白與底物複合物的晶體結構表明AlkB家族蛋白需要將鹼基翻進其活性中心才能催化該鹼基上的反應，由此推測摺疊好的rRNA上的m³U也並不太可能與FTO蛋白反應。在哺乳動物的其它RNA上並不存在m³U，唯一相似的是在沒有FTO同源蛋白的錐蟲 (Trypanosoma) 的mRNA端帽結構後的第四個鹼基U可以被二甲基化成3-methyl-2"-O-methyluridine (m³Um)，而對於人類mRNA端帽的研究表明人類mRNA端帽上卻並沒有這種修飾。

在證實了RNA上的m³U並非FTO的真實底物之後，為了尋找FTO的底物究竟是什麼RNA，我開始探索一些蛋白-RNA交聯技術以獲得FTO的底物序列信息。我與北京大學的陳鵬教授合作，合成並發展了含有二氮雜環丙烯基 (diazirine) 的非天然氨基酸光交聯探針 (Nature Chemical Biology, 2011, 7, 671)，並試圖將這個非天然氨基酸引入細胞中的FTO蛋白內並用紫外光將蛋白與底物進行交聯，由於種種原因這個光交聯探針並沒能獲得很好的蛋白-RNA交聯效率，我又把目光轉向了新發展出來的甲醛和光輔助交聯的RNA免疫共沉澱 (CLIP) 和利用4-硫代尿嘧啶(4-thiouridine, 4-SU) 輔助進行光交聯的RNA免疫共沉澱(PAR-CLIP)技術，在與FTO交聯的底物中，我們從中看到了一些RNA的存在，但並沒有看到DNA的存在，於是我們進一步相信RNA的確是FTO的底物，只是究竟FTO作用於RNA上的什麼鹼基仍不清楚。

在對FTO底物的尋找不甚順利的同時，我也開始尋找其他可能的RNA去甲基化蛋白。機緣巧合，2008年，何川教授在一次會議中遇到了同在芝加哥的一棟研究大樓但是隸屬於分子和細胞生物學系的潘滔教授，他主要的研究方向是tRNA和tRNA上的鹼基修飾，對於或許有酶能夠去除RNA上甲基化的可能性非常的激動，於是他們對於這個想法開始了緊密的合作，我也時常與潘滔教授討論我們的進展。當時潘滔教授實驗室發展了tRNA微陣列晶元技術，能夠定量檢測不同tRNA上的m¹A丰度 (RNA, 2010, 16, 1317)，經過一些討論，我們覺得AlkB的另一個同源蛋白ALKBH3或許具有成為RNA去甲基化蛋白的潛力。前人的研究表明ALKBH3能夠去掉被甲基化試劑處理過的RNA上產生的1-甲基腺嘌呤(m¹A)甲基化損傷。我則開始探索ALKBH3是否有可能去除掉細胞內天然存在的m¹A，通過使用tRNA微陣列晶元測量過表達和敲低了ALKBH3的細胞系中tRNA上m¹A的含量，我們發現有一些tRNA上m¹A甲基化變高了，另一些變低了，卻並沒有發現很明顯的趨勢。直到2014年，實驗室的另一項研究發現人體內AlkB的另一個同源蛋白ALKBH1實際上是具有這樣一個功能的一個蛋白，這又是後話了 (Cell, 2016, 167, 816)。

另一個出現在我關注範圍內的蛋白則是ALKBH8，這個蛋白除了AlkB功能域之外還有一個RNA結合功能域以及一個RNA甲基化功能域。我的最初假設是這兩個甲基化和去甲基化功能域能夠調控某個RNA底物的甲基化和去甲基化，由於這個蛋白的生化活性尚沒有人研究過，我開始在體外純化這個蛋白併合成不同的RNA底物與其反應。在研究的過程中我發現ALKBH8中的甲基化功能域與酵母中的某個甲基化蛋白在序列上十分相似，而酵母中這個甲基化蛋白負責催化tRNA上的一個複雜的多步鹼基修飾5-羧基甲基尿嘧啶甲酯 (5-methylcarbonylmethyluridine, mcm⁵U)中的甲酯基的形成，並能夠通過這些不同程度修飾的鹼基調控不同蛋白的翻譯強度。我進一步發現在蠶的甘氨酸tRNA上發現過這個鹼基修飾的另一個衍生物5-羧基羥甲基尿嘧啶甲酯 (5-methyl(carboxyhydroxymethyl)uridine, mchm⁵U)，基於對於AlkB家族蛋白的生化機理的了解，我意識到由於mcm⁵U中被氧化的碳原子並不是與氮直接相連，ALKBH8上的這個去甲基化功能域很可能僅僅履行了一步氧化將羧基甲基上的碳氫鍵氧化成了穩定的羥甲基，而沒有發生甲基的離去這個過程，這與後來發現的DNA去甲基化酶TET的生化反應過程如出一轍。在潘滔實驗室的成員Qing Dai的幫助下，我合成了帶有mcm⁵U的RNA底物，並用ALKBH8的AlkB功能域進行生化測試之後，我的這個猜想得到了證明 (Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49, 8885)。這個結果讓我喜憂參半，喜的是我發現了一個ALKB家族蛋白除了去甲基化之外的新的對於RNA鹼基多步修飾的功能，憂的是這並不是我們尋找已久的RNA去甲基化蛋白。

2010年初，在成功找到ALKBH8的底物之後，我把目光重新轉回了FTO，我意識到在2007年那篇報道FTO為去甲基化蛋白的文章以及實驗室成員賈桂芳此前進行的生化活性測量中，他們或許只測試過一些常見的甲基化鹼基，而沒有系統地測試過其它RNA上不是特別容易獲得的甲基化鹼基，於是我開始與Qing Dai合作合成並測試一些RNA上不那麼常見的甲基化鹼基，包括mRNA和非編碼RNA的端帽甲基化如7-甲基鳥嘌呤 (m⁷G), 2,2-二甲基鳥嘌呤 (m^2,2G), 2,2,7-三甲基鳥嘌呤三磷酸鳥嘌呤 (m^2,2,7GpppG)等等。但是這些底物與FTO蛋白反應後仍未看到任何活性，我頓時覺得無比沮喪，感覺我似乎已經幾乎窮舉完所有的可能性了，仍沒有找到更為有效反應的底物，這樣的底物究竟存不存在？

2010年8月，另一個與ALKB類似的蛋白JMJD6被報道為RNA結合蛋白，我開始表達提純JMJD6，並系統地測試這個蛋白在不同RNA底物上的活性，我知道N⁶-甲基腺嘌呤 (N⁶-methyladenosine, m⁶A) 是mRNA中含量最多的鹼基修飾，於是我從Qing Dai那獲取了他在之前的研究中使用過的含有m⁶A的RNA (Nucleic Acids Res. 2007, 35, 6322) 並進行了測試。雖然這次實驗的結果表明JMJD6並不能去除RNA m⁶A上的甲基化，但是與此同時，此前對FTO進行生化活性測量的賈桂芳意識到她在以前的實驗中其實並沒有測試過FTO在m⁶A上的活性，於是她合成了帶有m⁶A的單鏈DNA並迅速進行了測試，令人驚喜的是，m⁶A上的甲基竟然像m³T和m³U上的一樣被FTO去除了。一扇大門從此開啟。