液體活檢：帶你窺探腫瘤的更多秘密

這種革命性的技術有望明顯改善疾病診斷、監控和生存期預測。目前，它們主要用於癌症的檢測，不過隨著技術的進步，科學家相信液體活檢有望檢測更多的疾病，包括糖尿病、囊性纖維化和牙周炎等。

根據Kalorama Information最近出具的報告，2016年全球液體活檢市場的規模大約為3.94億美元。Kalorama預計，2021年這個市場的規模將達到13億美元，而2027年更是有望達到33億美元。

液體活檢的對象是生物體液中的各種組分，包括遊離的循環腫瘤細胞（CTC）、循環腫瘤DNA（ctDNA）、外泌體（exosomes）、蛋白質和RNA等。

循環腫瘤DNA

ctDNA是片段化的DNA，由癌細胞在凋亡或壞死過程中釋放到血漿。ctDNA片段極其稀少，這使其分離和鑒定都變得十分困難。由於總的遊離DNA（cfDNA）樣本中存在少量ctDNA，因此建議使用高度靈敏的技術來檢測，比如PCR和新一代測序（NGS）。目前，ctDNA已經用於肺癌患者的臨床管理和晚期黑色素瘤的疾病狀態監控。

今年5月，Cancer Genetics公司基於賽默飛世爾的Oncomine? Lung cfDNA assay，推出了Liquid::Lung-cfDNA?，可檢測肺癌來源的cfDNA。此產品能夠分析與非小細胞肺癌相關的11個基因中的單核苷酸變異（SNV）和小的插入缺失（indel）。

該公司的CEO Panna Sharma認為：「使用NGS或數字PCR的液體活檢技術比傳統的組織活檢更有優勢。我們認為，一旦建立了基本的診斷和治療方案，液體活檢能降低檢測相關的成本和負擔，提供一個更全面的縱向生物標誌物圖譜，並提高早期檢測的敏感性。」

加州大學聖地亞哥分校的一個團隊也從事ctDNA研究，希望能夠找出一些生物標誌物，預測患者對免疫檢查點抑製劑的反應。利用69名患者的血液樣本，研究人員通過NGS分析了ctDNA。具體而言，他們統計了臨床意義未知的變異（VUS）數量。研究發現，29%的患者存在三個以上的VUS改變。

經過免疫檢查點抑製劑治療後，VUS達三個以上的患者響應率（45%）明顯高於VUS三個或以下的患者（15%）。「我們的研究表明，ctDNA變異的數量與檢查點抑製劑療法的響應相關聯，」個性化癌症治療中心的主任Razelle Kurzrock說。

循環腫瘤細胞

CTC是從原發性或繼發性腫瘤上脫落並進入血液循環的完整腫瘤細胞。CTC的存在，意味著患者患有轉移性疾病。對於大多數癌症患者而言，CTC的丰度極低，因此活檢通常從富集步驟開始，以便提高CTC的濃度。目前，CTC檢測的主要臨床應用是提供預後生存預測。

Complete Genomics和加州大學舊金山分校的研究人員最近報告稱，他們僅利用5個CTC，就能檢測到臨床相關的突變。他們的研究對象是一位61歲的女性，患有ER+和HER2-的轉移性乳腺癌。

在研究過程中，他們首先分離出34個高純度的CTC，然後再將CTC中的基因組DNA分到3,072個單獨區室中，而每個區室中大約含有5%的癌症基因組。接著，每個區室中的DNA被標上唯一的條形碼，之後混合所有DNA，開展全基因組測序。

Complete Genomics負責研發的高級主管Brock Peters博士指出：「通過這34個細胞，我們能夠準確檢測低至12%的CTC中存在的突變，確定其組織來源，並制定個性化的聯合療法。」

蛋白質組技術

據Integrated Diagnostics公司的CEO Al Luderer博士介紹，與DNA或RNA等生物分子相比，蛋白質有著更好的信噪比。「蛋白質通常經歷了漫長的生物合成，這個過程意味著蛋白質是基於特定的功能原因而存在，往往是長期存在的，幾乎沒有可檢測的合成副產物。」

IndiDx利用蛋白質組學的進展來更好地診斷複雜疾病。它的突破性產品是Xpresys? Lung 2，該產品可以測定血液蛋白質，並鑒定良性的肺結節。「當肺癌出現癥狀時，通常已經是III期或IV期疾病，」Luderer說。「如果在肺結節很小且沒有癥狀的時候發現它們，那麼就有很大的機會治癒。不過肺結節的診斷是個挑戰。」

Xpresys Lung 2可以協助醫生確定哪些患者採取保守治療的效果最好。如果檢測結果表明結節是良性的，則患者可採用觀察等待（watchful waiting）的保守療法，也就是在兩年內進行一系列的低劑量CT掃描。這種對患者肺結節的主動監測可作為一種安全保障，一旦肺結節惡變，則可以儘早進行治療干預。

RNA標誌物

德克薩斯大學奧斯汀分校的研究人員則另闢蹊徑。他們正在研究細菌中一種古老的酶，這種酶高度準確地檢測到多種RNA標誌物。

「DNA標誌物是靜態的。它們提供了突變的信息，但無法告知這些突變對細胞進程的影響，這在不同個體中是有差異的，」Alan Lambowitz博士觀察到。「致癌突變可能有不同的影響，並對治療作出不同反應，這是個性化醫療的一個重要考慮因素。」

相比之下，「監控細胞內的RNA能夠確切地告知病變組織（如癌症）在特定時間到底發生了什麼，」Lambowitz說。「這種方法可用來定期監控疾病的發展以及對治療的反應，並預測身患同一種癌症的不同個體將對不同療法有何反應。」

Lambowitz預計，液體活檢與其他工具相結合，將為專業人士提供所有的信息。他們研究的這一組酶稱為TGIRT（熱穩定的II組內含子逆轉錄酶）。TGIRT尋找RNA鏈，並形成互補的DNA鏈，這些鏈在測序後可提供診斷方面的信息。據Lambowitz介紹，由於它們能夠從極其少量的RNA中準確生成DNA拷貝，故TGIRT能夠在基於RNA的液體活檢中更好地發揮作用，捕獲疾病的生物標誌物。

參考標準

當然，液體活檢分析也面臨不少挑戰。其中，最主要的挑戰是利用少量DNA來檢測低頻率的突變。因此，這些分析必須足夠靈敏，才能檢測等位基因頻率低至0.1-0.01%的突變。

於是，人們專門設計了參考標準，來解決液體活檢所帶來的挑戰。Horizon Discovery的Reference Standards來源於人類細胞系，被打斷成平均160 bp的片段。它們覆蓋等位基因頻率為5%、1%和0.1%的臨床相關突變，以便模擬從真正的血漿中提取出的cfDNA。

未來在哪裡？

儘管有美好的前景、豐富的研究和巨大的投資，但在眼下甚至不遠的將來，液體活檢也不能完全取代組織活檢。「由於癌症的組織病理學結果才被認為是生物學的真相，而幾乎所有的治療決定都依賴於真正的病變組織，所以組織活檢在目前看來是無法取代的，」Luderer說。

Sharma則更加樂觀一點。她說：「我們預計在未來三年內，實體瘤的大多數藥物監控和疾病檢測將轉向基於體液或血液的分子方法。」而且，我們越了解腫瘤的分子組成，以及其診斷、預測和預後的價值，我們對傳統組織活檢的依賴就越少。