循環腫瘤標誌物在肺癌中的應用

中國肺癌雜誌2 0 1 5年1 2月第1 8卷第1 2期 Chin J Lung Cancer, December 2015, Vol.18, No.12

周彩存

作者單位：200433 上海，上海市肺科醫院腫瘤科（通訊作者：周彩存，E-mail: caicunzhoudr@163.com）

【摘要】近年來，「液態活檢」概念異軍突起，不僅可以輔助診斷某些類型實體腫瘤，而且能夠監測複發，評估療效及肺癌分子表達，更是無創腫瘤篩查方法。其來源主要分為循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs），循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）等。本文討論了肺癌領域中CTCs、ctDNA及其他腫瘤標誌物的生物學特徵、檢測方法及臨床應用，總結了保證特異性前提下的高敏感度、便於臨床應用、可重複性好三個重要評判標準的「液態活檢」技術，尤其是肺癌I期敏感度可達67%的靶向PCR CTC技術的應用，以期使「液態活檢」真正從科研探索走向臨床應用。

【關鍵詞】液態活檢；循環腫瘤細胞；循環腫瘤DNA；靶向PCR

        隨著分子生物學的快速發展，「精準醫療」已經成為了腫瘤診療新進展中最為熱門的辭彙之一。在腫瘤臨床診療過程中，特別是肺癌的臨床實踐中，先明確腫瘤的基因組學類型，是臨床治療的第一步。諸多研究已經證實，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變與ALK融合基因表達的患者接受相應的靶向治療的療效顯著優於含鉑雙葯化療^[1-3]。因此，國內外的臨床指南均推薦肺腺癌患者在接受治療前必需接受基因檢測^[4,5]。但是，如果接受基因檢測，患者必需接受有創的組織活檢，患者所受損傷較大。另一方面，靶向藥物通常會在10個月左右產生耐葯^[6]，如何提供有效的手段監測耐葯，同時提示耐葯機制便成為非常重要的步驟。

        基於如上原因，「液態活檢」的概念應運而生，有文獻^[7]報道，液態活檢是指運用敏感的血液學檢測方法在千萬背景血細胞中檢測並分析潛在的腫瘤細胞。簡而言之，就是通過血液檢測代替腫瘤組織檢測。隨著各種高敏感度檢測方法的問題，液態活檢如果按其來源可分為循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、小分子RNA（mircoRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA）等腫瘤。目前臨床常用主要為CTC和ctDNA。

        已有較多研究^[8-11]探索了CTC和ctDNA在肺癌診療過程中的應用前景。其中，CellSearch的CTC檢測在乳腺癌領域已經有被CFDA批准的檢測方法。但是，由於大部分肺癌細胞遷移入血的過程中容易出現上皮間質轉化的過程，從而丟失了表面上皮粘附分子的表達。而上皮粘附分子又是CellSearch系統主要的捕獲靶標，因此，CellSearch在肺癌中的CTC檢測結果並不盡如人意。因此，國內有多種改良技術，在肺癌領域探索了其他方法檢測CTC的效率。另一方面，ctDNA檢測在國內也處於臨床探索的熱點。因此，本文主要對於CTC與ctDNA的檢測方法、臨床應用的側重點、未來的研究方向進行綜述，期望能為臨床合理嘗試「液態活檢」提供依據。

1 CTCs

1.1 CTCs的前世今生

        1869年，澳大利亞一名叫Thomas Ashworth的內科醫生^[12]，他通過顯微鏡觀察到一例死於轉移瘤患者，其外周血中存在與原發腫瘤相似的細胞，這樣的細胞或許能反映原發腫瘤的特性，被稱為CTCs。由於檢測手段的限制及細胞的稀少，直到20世紀90年代，CTCs的價值才被內科醫生充分認識到。1889年英國病理學家Paget提出了著名的「種子和土壤」假說（seed and soil hypothesis）^[13]。該假說強調腫瘤細胞和靶組織兩個導致腫瘤轉移的重要因素，認為器官微環境（「土壤」）可影響特定腫瘤細胞（「種子」）的種植、侵襲、存活、生長，腫瘤轉移早期常呈現特異臟器親合性。其中，CTCs 即是該假說中的「種子」，在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用。此學說成功地闡釋了癌症複發和轉移的機理。臨床研究^[14-16]顯示，CTCs在肺癌的輔助診斷、複發監測、療效評估及檢測肺癌分子表達譜中具有重要的臨床意義。

1.2 CTCs的生物學特徵

        腫瘤原發灶或者轉移灶中，具有轉移傾向一類腫瘤細胞，通過EMT等生物學行為，遷移入血稱之為CTC，其可分為具有幹細胞特徵的CTC和不具有幹細胞特徵的CTC^[17]。CTC遷移入血的生物學過程目前尚無明確定論。CTC一旦遷徙入血，其存活時間一般較短，通常不會超過24 h；而且，就其形態而言，CTC具有高度的異質性^[18]。因此，即便通過最溫和的分離技術，循環還是經常可以檢測出已經凋亡或者破壞的CTC。

        循環中檢測出CTC並不一定意味著患者已經存在遠處轉移。腫瘤轉移是個相對複雜的過程。CTC侵襲入原發灶以外的第二器官（如骨髓等），可稱之為播散的腫瘤細胞（disseminated tumor cells, DTC）^[19]。一般而言，具有幹細胞特徵的DTC聚集成團，並且形成微轉移灶，同時該轉移灶可以逃避免疫系統的識別，腫瘤的遠處轉移才可能發生^[17,20]。在腫瘤的浸潤和轉移過程中，腫瘤細胞會表現出更多的間葉表型特徵，失去正常情況下細胞間的相互作用，即存在上皮-間葉轉換（epithelial mesenchymal transitios, EMT）過程，從而使其更容易侵入血管內皮而進入血循環^[21]。在 EMT過程中，腫瘤細胞下調了上皮組織特定標記物如角蛋白（cytokeratin, CK）和上皮細胞粘附分子（EpCAM）的表達，上調了間葉組織標記物如波形蛋白的表達^[22,23]。但是，EMT並不是一個「全或無」的過程，很多CTCs可以同時表達間葉組織標記物和上皮組織。這對現行的一些CTCs的檢測方法有著重要的影響。例如針對上皮組織標記物的檢測方法就無法檢測到發生EMT的CTCs。

        另外一個重要的問題是，早期腫瘤外周循環中是否可以檢測到CTC，也就是說CTC遷移入血的過程是發生在腫瘤早期還是晚期？理論上講，腫瘤大小超過2 mm左右時便可誘導血管生成進入腫瘤，提供血供，從而為腫瘤細胞遷移入血提供基礎。Husemann等^[24]通過研究證實，在轉基因小鼠種植後約17-18周，循環中即可檢出CK與HER同時陽性表達的細胞，而此時原發腫瘤體積還小於1 mm3。另有研究^[25,26]結果也再次印證了上述結果，其中He等將表達中等量葉酸受體（folate receptor, FR）的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側面。移植2周後，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞。而到了移植後的第3和4周，則每分鐘可分別檢測7和18個CTC。隨著腫瘤逐漸增大，CTC的數量呈指數級別上升。在腫瘤移植的前4周內，沒有在任何組織切片中發現到存在轉移性癌症的跡象。因此，理論上而言，在腫瘤發生髮展的早期，循環中即可檢出CTC。

        基於CTC的生物學特徵，有學者^[27]認為，CTC可用於評估腫瘤發生髮展的狀態與治療的療效。且目前的檢測方法均是用循環中單位體積血液中CTC的數量用以進一步的分析與評估整體病情。因此，CTC在肺癌領域可以發揮類似腫瘤標誌物的作用，用於肺癌的輔助診斷、治療療效的評估、術後隨訪中監測複發。另一方面通過CTC的進一步分析，其亦可用於檢測肺癌分子表達譜從而指導臨床治療或者探索肺癌發生髮展的分子生物學行為。

1.3 CTCs的檢測方法

        由於CTCs在其外周血中的數量很少，每105-107個有核細胞中才有一個CTCs^[28]，因此對CTCs的檢測技術要求更為準確、敏感。CTCs的檢測方法主要分為兩部分：CTC富集技術和CTC檢測技術。

        目前能夠檢測到外周血中的CTCs的很多方法利用諸如EpCAM、CK等上皮特異性標記物等，但是這些標記物在CTCs中的表達多樣，並且存在EMT，因而檢測結果可能偏低^[29]。另外，EpCAM也不是在所有類型的上皮細胞癌中都有表達。通常情況下，血細胞不表達上皮細胞標記物，但一部分白細胞，如巨噬細胞，其CK染色和其他的一些上皮細胞特異性抗原染色卻呈陽性^[30]。因此，同時進行多種上皮細胞標記物陽性染色和白細胞標記物CD45的陰性染色，成為檢測 CTCs 的常規方法。但是，最近有非常多的新型檢測方法，已經顯示出較為確切的臨床價值。

        總體而言， CTCs的檢測方法很多，而理想的CTC檢測方法應該是：高敏感度，易於臨床應用和結果可重複（表1）。

1.3.1 CTCs富集技術

         CTCs的富集方法主要基於CTCs的物理學特徵（大小、密度、電極、可變行性）和生物學特性（細胞表面蛋白、生存能力和侵襲性）進行富集。常用的富集方法有：

        ① 密度梯度離心法：利用商品化的分離液，將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，根據血液中各種細胞的密度不同，離心後各種細胞成分分層，從下向上依次為：紅細胞、中性粒細胞、分離液、單個核細胞（包括CTCs），最上層是血漿，為防止離心前血細胞與分離液混合而不利於分離，建立了OncoQuick 方法，用一種專用的50 mL試管，在分離液與血液之間放置多孔屏障，這種方法的局限性是部分腫瘤細胞可遷移至血漿層或在離心管底部形成非特異性的聚合物而丟失 CTCs^[31]。

        ② 膜過濾法：2000年主要是利用腫瘤細胞與正常細胞大小不同來分離CTCs的ISET（isolation by size epithelial tumor cells）技術被Vona等^[32]提出，血液通過孔徑8 μm的濾膜過濾，使CTCs聚集於濾膜上，達到富集作用。離心法是在濾膜原理基礎上，利用一個內置多孔屏障的專用50 mL試管進行密度梯度離心，避免了全血各個層面的交叉污染，檢出率明顯高於其他方法^[33]。此類富集技術簡單、方便，可以普遍使用。適合富集任何類型腫瘤的CTCs，富集的CTCs可以繼續後續免疫學和基因檢測。但由於需要血液標本量大，而且容易出現交叉污染和CTCs的丟失，限制了其進一步應用。過濾法尤其會丟失直徑小於濾膜孔徑的更有侵襲性的CTC。同時，處理時間過長也是其局限之一。

        ③ 免疫磁珠分離法：免疫磁珠分離法將抗原抗體反應的高度特異性和免疫磁珠的富集分離作用相結合，達到特異性的生物活性物質和細胞的富集效果，並可對細胞進行形態學分析。從原理上分為陽性（正向）富集和陰性（負向）富集。陽性富集通過腫瘤相關性抗原的抗體直接從外周血中富集得到CTCs，多為基於CTC的某一特徵（如表達EpCAM）的正向富集，雖然這類技術分離的CTC純度較高，但是會造成某些不具有這些特徵（如表達EpCAM）的CTC的遺失，讓分析從一開始就具有偏向性。陰性富集是通過白細胞相關性抗原CD45等去除白細胞，最大程度的將最易干擾CTC檢測的白細胞去除，以此逐步將血液中的血漿、紅細胞和白細胞去除，最大程度的保留了稀有的CTC，實現了CTC近100%的回收和富集。上皮細胞通常表達EpCAM、CK和BerEP4，而血細胞不表達，正常血液中亦無上皮細胞，90%的實體瘤來源於上皮細胞，因此，針對 EpCAM、CK和BerEP4分子的抗體能用於CTCs的分選。目前CellSearch系統就是基於EpCAM陽性富集得到CTCs，用於臨床檢測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者外周血中的 CTCs^[34]。

        ④ 微流體晶元（micro-fluidic chip）分離技術：微流體晶元分離技術可以用來處理更大容量的血液標本，可以檢測出血液中極微量癌細胞的微流體硅晶元，其表面有數萬個包被抗體的微位點，當血液樣本流過晶元時，該抗體可與腫瘤細胞結合，因而被粘附在晶元上。目前已經成功開發出第二代機器，為HB-Chip（herringbone-chip）^[35]，為CTCs更精細的分析奠定了基礎。

1.3.2 CTCs檢測技術 

        CTCs的檢測也是通過對CTCs特異表達的腫瘤或上皮蛋白或mRNA來進行的。主要方法包括配體靶向PCR法（ligand-targeted PCR method, LTPCR）、免疫熒光法（immunof luorescence, IF）、流式細胞術（flow cytometry, FCM）、逆轉錄-聚合酶鏈反應（reversetranscriptase PCR, RT-PCR）和酶聯免疫斑點法（enzymelinked epithelial immunospot assay, ELISPOT）。

        ① LT-PCR：該方法是目前最新的CTC檢測技術，而且為國內原創。其原理是肺癌等CTC表面會過量表達某些特異性受體，如葉酸受體（folate receptor, FR）^[26]，靶向PCR利用的配體類似物交聯核苷酸片段作為檢測探針，通過細胞表面特異性受體與其配體類似物的結合來實現探針與CTC細胞的結合，從而將CTC數目轉化為探針的數目，並且通過對探針的PCR定量檢測來計算CTC的數目。傳統的細胞免疫熒光分析往往對純度要求很高，負向富集純度往往滿足不了。由於具有受體配體結合（1個CTC表面存在上萬個特異性受體）及PCR的兩次信號放大，從而可使1個CTC信號放大約1012倍。因此，配體介導的靶向PCR法，具有超高的靈敏度的特點，從而使早期肺癌中探測CTC成為了可能。目前，已有多篇文獻^[36,37]報道了該種方法在肺癌的輔助診斷中的作用。其主要通過FR識別肺癌CTCs。已有發表的組織活檢數據^[38-41]顯示約83%的肺癌細胞表面過量表達FR。人FR有三種亞型：FR-α、FR-β和FR-γ。FR-α的表達具有很強的組織和腫瘤特異性，除在少數正常組織（腎、胎盤、脈絡叢）有表達之外，在其他正常組織中表達水平非常低。是一種理想的CTCs篩選靶標，保證了特異性。

        ② IF：IF是指以熒游標記的特異性抗體在CTC原位通過抗原抗體反應，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。該技術的優勢在於CTC的鑒定與可視化上，通常而言，認為循環中有核細胞的CK陽性而CD45陰性可鑒定為CTC^[42]，可伴有或者不伴有其他特殊類型的細胞表面受體陽性（如前列腺癌中的雄激素受體）^[43]。但是，對於部分但形態學判斷為CTC但CK陰性/CD45陰性，或者CK陽性/CD45陰性但形態學上小於白細胞的CTC則需要有經驗的醫生來判讀。另一方面，由於採用熒光顯色，1個CTC在顯微鏡下通常只有一個熒光顯像，所以缺乏信號放大的過程，總體而言該方法的特異性較高但敏感性較低。目前國際上最常用的CellSearch CTC檢測系統便是使用免疫熒光法，但是目前只被批准適用於轉移性的乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的CTCs的檢測^[44-46]。Tanaka等^[47]有研究證實，其在肺癌領域的敏感性較低，通過CellSearch系統檢測101例原發性肺癌患者的CTCs，發現在7.5 mL外周血中，只有32%的IV期肺癌患者外周血能見到CTCs，IIIa期患者的檢出率為0^[48]。這主要是因為CellSearch系統主要通過上皮表型EpCAM來識別CTCs。而肺癌CTC在遷移入血的過程中通常會發生EMT，從而丟失了上皮細胞特徵^[49]。因此，以上皮表型EpCAM來檢測肺癌CTCs的方法，可能會產生假陰性的結果。

        ③ FCM：FCM是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。他可以高速分析上萬個細胞，同時從一個細胞中測得多個參數。他利用熒光抗體結合腫瘤細胞使腫瘤細胞染色，然後用流式細胞儀進行分析，還可以對同一個細胞有關物理、化學方面的特性做多參數分析。與傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優點。

        ④ RT-PCR：RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，是PCR的一種廣泛應用的變形，標記組織或腫瘤中某種物質的mRNA作為檢測指標，可以檢測很低拷貝數的RNA。通過RT-PCR法擴增腫瘤細胞特異性或組織特異性基因，能高度靈敏地從106-107個正常細胞中檢測出1個腫瘤細胞，較免疫熒光至少靈敏100倍，是目前檢測腫瘤隱匿微轉移最有效的方法^[50]。此方法的局限性在於合適的目的基因選擇困難，樣本污染容易出現假陽性結果，檢測時需要裂解細胞限制了CTCs的進一步使用。

        ⑤ ELISPOT：ELISPOT利用活細胞能產生或分泌特異性蛋白的特性，與包埋在培養皿底部的熒光抗體結合，通過檢測熒光而間接檢測CTCs，這種方法首先應用免疫磁珠分選去除CD45陽性細胞，富集CXCR4（腫瘤轉移相關蛋白）陽性的細胞，從而進一步檢測分泌特異性蛋白的CTCs。但這種方法只能識別活細胞，因為死亡的細胞不能夠分泌足夠的蛋白用於檢測^[51]。

1.4 CTCs的臨床應用

1.4.1 輔助診斷 

        目前對肺癌的診斷和分期主要基於影像學或病理學檢查的結果，對於精確反映腫瘤細胞血循環微轉移對患者治療及預後的影響有一定難度，而CTCs檢測則可以彌補這一缺陷。腫瘤轉移的重要途徑是血液系統，判斷臨床分期的標準之一是是否發生遠處轉移。研究結果表明，CTCs與腫瘤分期密切相關，對肺癌診斷具有潛在的應用價值^[47,59,60]。Sher等^[14]研究發現晚期肺癌患者外周血CTCs陽性率明顯高於早期患者，提示結合患者外周血情況，能更準確反映患者的疾病分期和病情發展傾向。如上所述的FR靶向PCR CTC檢測技術，通過受試者工作特徵曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析發現，當確定以8.64 CTC Units/3 mL作為cutoff值時，其診斷肺癌的敏感度為80%，特異性為88%。特別值得一提的是，該方法對I期NSCLC患者的診斷靈敏度達到67.2%。II期、III期、IV期NSCLC患者陽性檢出率分別為69.4%、80.9%、100%。與一般腫瘤標誌物（NSE、CEA、CYFRA211等）相比，基於FR靶向PCR的CTC檢測方法具有更大的曲線下面積（0.823）和約登指數（0.573），且更易去辨別患者是NSCLC還是健康志願者/肺部良性疾病患者。總體而言，該方法對於肺癌輔助診斷的敏感度（特別是早期肺癌患者的診斷）顯著優於目前常用的一般腫瘤標誌物^[37]。

        另外，CTCs可在患者出現明顯轉移前提供預後信息，提高風險評估，並為需要治療的患者作出指示，所以CTCs檢測有可能應用於國際分期系統，作為腫瘤分期的有益補充^[61]。

1.4.2 複發監測 

        由於CTC可以評估腫瘤的發生髮展狀態，而且手術切除原發灶後，血液中CTC數量應該為陰性。因此，理論上而言，在術後監測過程中，CTC數量陽性，可能提示腫瘤存在複發的可能性。

        目前僅有少數研究在這方面進行了探索，Sawabata等^[62]對9例接受肺葉切除術的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者進行了術前術後的CTC檢測。結果發現1例患者術前在外周血中檢出CTC，而有3例患者在手術後即刻檢測中在外周血中發現了CTC，所有患者在術後10 d以後均無法檢出CTC。對於CTC在複發監測中的作用，仍需更多研究來探索。

1.4.3 療效評估 

        目前的研究顯示，CTCs數目和腫瘤的進展、接受藥物治療後的療效密切相關^[63,64]。Punnoose等^[65]用細胞搜索系統檢測了41例患者外周血的CTCs數量，這些患者參加了厄羅替尼及pertuzumab治療NSCLC的單臂二期臨床試驗，研究者對其療效進行氟代脫氧葡萄糖-正電子發射型計算機斷層顯像（f luorodeoxyglucose-positron emission computed tomography, FDG-PET）和計算機斷層掃描（computed tomography, CT）評價，78%的患者在基線水平上可檢測到大於1個CTCs，在評估療效上CTCs數量的減少與FDG-PET影像學檢查和按照實體瘤的療效評價標準結果一致並與較長的疾病進展期（progression-free survival, PFS）相關，CTCs的減少是治療有效的早期指標。另有一項研究評估了CTC數量波動對化療療效的評估作用。研究共檢測了25例轉移性肺癌患者接受化療前和化療2個周期後的CTC數量。結果發現，CTC數量的前後變化與影像學表現一致，CTC下降、無變化、上升患者的無進展生存期分別為2.05個月、3.25個月和8.35個月（P<0.05），提示CTC比一般腫瘤標誌物更能反映腫瘤接受化療後的變化^[56]。

1.4.4 評估肺癌分子表達

         如基因表達分析和全基因組分析等現代基因工程技術正在越來越多地用於提供CTCs分子結構上的信息，已檢測到CTC的基因異常與原發灶癌細胞基本一致，包括基因擴增和（或）幾種癌基因的等位基因缺失^[66]、不正常的端粒酶活性^[67]和非整倍體的變化^[68]。CTCs上亦可檢測到惡性腫瘤的分子足跡^[69]。如CTCs上各類上皮蛋白質可能為轉移提供特異性標記^[70]如細胞骨架相關細胞因子、信號激酶、生長因子受體或表面粘附分子等的變化。

        另外，NSCLC特別是肺腺癌在接受治療前必需先同時評估EGFR與ALK基因狀態，以此指導後續靶向治療。雖然，大部分方法檢出CTC的敏感度較低，但是一旦富集出CTC，其檢測肺癌EGFR突變與腫瘤組織對比具有較高的一致性。Maheswaran等^[15]從20個外周血中檢測出CTC的NSCLC患者中，組織與外周血CTC對EGFR突變檢測的一致率達到了95%，同時亦可以通過檢測T790M突變監測患者的耐葯。另一項發表在J Clin Oncol的研究^[71]則評估了在CTC中用FISH方法檢測ALK融合基因的可行性。研究共檢測了32例晚期NSCLC患者CTC中ALK融合基因表達，其中18例組織學檢測為陽性患者中，CTC均為ALK陽性（ALK陽性細胞數大於4個），14例組織學ALK陰性的患者，CTC中ALK陽性細胞表達僅為小於等於1個；並且，CTC中ALK陽性細胞數可用於評估克唑替尼治療的療效。

        如上所述，CTC用於肺癌分子基因診斷的不足之處在於CTC本身的檢出率低，但就目前的研究結果來看，一旦外周血中富集出足夠量的CTC，其基因檢測與組織學對比的一致率較高。因此，需要富集效率更高的方法，能夠最大程度上完整保留外周血中的CTC，成為此方面研究探索的重要方向。

2 ctDNA

        血漿遊離DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中遊離存在、不包含在完整細胞結構內的DNA。循環系統中存在cfDNA早已得到證實。目前，cfDNA可能來源於以下三種情況：①來自於細胞的凋亡進程中片段化的DNA；②來自於壞死的細胞的DNA碎片；③來自於細胞分泌的exosome。其中，cfDNA主要來源於細胞凋亡。

        循環腫瘤DNA（ciuculating tumor DNA, ctDNA）是指腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡後釋放進入循環系統。ctDNA是人體血液循環系統中不斷流動的攜帶一定特徵（包括突變、缺少、插入、重排、拷貝數異常、甲基化等）來自腫瘤基因組的DNA片段。ctDNA就是來源於腫瘤細胞的cfDNA^[72]，屬於cfDNA的一種類型。ctDNA不同於遺傳突變的是其來自腫瘤細胞的體細胞突變，而cfDNA存在於體內的每個細胞^[73]。ctDNA來源：①來自於壞死的腫瘤細胞；②來自於凋亡的腫瘤細胞；③CTC；④來自於腫瘤細胞分泌的外排體^[74]。

2.1 ctDNA分析技術

        由於腫瘤特異性的ctDNA並不存在於正常細胞中，他們為癌症檢測提供了一種十分敏感和特異的方法。血漿收集技術層面也許會影響ctDNA水平。由於脫氧核糖核酸酶活性，ctDNA在血液中穩定性有限，因此抽血後，包括cfDNA的準備步驟在內不能超出數小時。通常而言，外周血中每毫升血漿中含有17 ng的DNA^[74]，但其中ctDNA含量低，約佔整個循環DNA的1%，甚至只有0.01%^[75,76]。檢測ctDNA的第一步是抽提外周血中的遊離DNA，目前較為通行的抽提方法大約需要1毫升血清或者血漿（3 mL全血，乙二胺四乙酸抗凝），抽血後4 h-5 h內即需要完成抽提步驟。在肺癌領域，ctDNA中檢測單個基因突變（如EGFR突變）的檢測方法較多，如液相色譜法、突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system, ARMS）法、數字PCR、二代測序法等。總體而言，BEAMing數字PCR法的敏感性最高，可達0.01%，其他方法的敏感性約為1%^[77]。中國學者在這方面也報道了較多的關鍵研究。2009年王潔教授有研究^[78]報道了其用液相色譜法在230例NSCLC患者的外周血中檢測EGFR突變的研究。結果顯示，患者血漿與組織中EGFR突變的一致率87%，其中組織EGFR突變的77例患者中，63例血漿中檢出EGFR突變；組織EGFR野生型的153例患者中，137例血漿中檢出EGFR野生型，血漿與組織的相關係數為0.74。在2015年歐洲肺癌年會公布的IGNITE研究^[79]中，研究者比較了2,581例NSCLC患者配對的組織學或者細胞學標本與ctDNA標本的EGFR突變吻合度。結果顯示，在真實世界中，血液檢測較組織學/細胞學檢測具有較高的特異性，在亞太地區患者中達到97.2%，說明血液檢測的假陽性率低，血液檢測EGFR基因突變的敏感性為49.6%，血漿與組織的一致率為58%。就上述兩篇研究可以看出，ctDNA檢測EGFR突變的特異性較高，而敏感性較低，因此對於血漿EGFR突變陰性結果的解讀必需慎重。

        就目前而言，對肺癌患者的ctDNA進行多基因甚至是全基因組分析，大部分使用的是二代測序技術。而二代測序技術中，常規的全基因組分析方法由於cfDNA中腫瘤基因組的含量較少，非常容易被大量生殖系基因組學變異（如基因融合與基因拷貝數增加）所埋沒。另一方面，如需檢測ctDNA中的ALK融合或者ROS1融合，由於包含融合點的DNA序列更為稀少，因此，對二代測序法的測序深度提出了極高的要求^[76,80,81]。這一困難，目前正在被新的二代測序技術所逐漸解決。2014年Nature Medicine雜誌中，Newman等^[82]使用一種稱之為深度測序腫瘤個體化建檔法（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPPSeq）的超敏感二代測序法檢測非小細胞患者的ctDNA中特定的腫瘤基因變異。該方法的主要原理為採用RNA探針捕獲技術結合二代測序平台檢測基因組變異，由於只需擴增探針捕獲的目標DNA序列，且在捕獲片段的兩端加上接頭使每一條DNA片段的3』端和5』端完全相同，因此在測序深度能大大提高的同時保證了擴增的特異性。因此，可有效檢測ctDNA中的包括ALK與ROS1融合在內的各種基因突變。

2.2 ctDNA的臨床應用

        在1989年，Stroun等^[83]首先對腫瘤患者體內的遊離循環DNA的序列進行了檢測，在腫瘤患者體內的遊離循環DNA上相繼檢測到K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突變。近年來有較多研究對ctDNA的臨床應用進行了探索。但是在循環腫瘤標誌物中，ctDNA與CTC因其來源不同，評價標準不同，生物學特徵不同，兩者可能側重於不同方面的臨床應用（表2）^[84-86]。

        由於ctDNA檢測基因變異相對快速、便捷，可應用高通量的測序方法，並且部分腫瘤外周血中ctDNA的表達水平高於CTC。因此，對於基因檢測方面，雖然兩者可互為補充，但可能ctDNA更具一定優勢^[87,88]。對於EGFR突變檢測，如上所述的研究已經證實了ctDNA檢測EGFR突變的可靠性。因此，美國和中國均已有官方批准的血漿檢測EGFR突變的商業試劑盒。對於ALK融合基因檢測，目前尚無明確的標準檢測方法，有文獻報道使用濾膜法聯合FISH探針可檢測到外周血CTC中的融合基因。針對ctDNA，CAPP-Seq則是較為可行的檢測方法之一，但其問題在於DNA層面，融合基因的融合位點往往都在內含子部分，且大部分為隨機斷裂，因此捕獲探針的設計便顯得尤為重要。一般而言，由於特異性較高，且有大量文獻證實，ctDNA中檢出EGFR敏感突變可用於指導臨床治療的參考，而檢測ALK融合基因或者其他驅動基因表達則需要進一步的臨床數據來證實。

2.2.2 肺癌輔助診斷 

        由於ctDNA來源於腫瘤細胞的壞死和凋亡，因此，理論上來說，早期腫瘤外周血中即可能存在ctDNA，但是可能極為微量。二代測序方法與微滴式數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的敏感度均較ARMS法敏感度高，且可以同時分析多個變異的基因。因此，通過檢測ctDNA來輔助診斷肺癌方面，二代測序法具有比較明顯的優勢。有研究通過CAPP-Seq方法檢測13例肺癌患者和５名健康人外周血中的遊離DNA，通過檢測其中突變或者融合基因來輔助診斷肺癌。研究結果發現總體而言，II期-IV期肺癌與I期肺癌的敏感性分別為100%與50%，特異性為96%，對於所有肺癌患者診斷的AUC值為0.89。而且ctDNA的表達量與腫瘤大小相關，相關係數為0.89（P=0.000,2）。由此，研究者認為基於高通量的二代測序技術檢測ctDNA中的腫瘤基因變異可用於診斷NSCLC。但是，畢竟ctDNA與CTC不同，循環中遊離DNA的來源各異，無法判別來源，且不同時間點遊離DNA的表達量亦不相同。另一方面，肺癌的異質性較大，突變譜也較廣泛^[89]，通過ctDNA診斷肺癌的標準尚未統一，是否循環中檢測到某種基因變異或者某幾類基因變異的組合即可診斷肺癌，目前尚無定論。而對肺癌患者的腫瘤組織和相應的血漿血清中的遊離循環DNA進行一些基因啟動子區的甲基化檢測，發現大多數的肺癌患者都存在一些基因啟動子區高甲基化的現象^[90]。這個方法因此也可以被用來肺癌患者的早期診斷和存活率的檢測中。在肺癌患者體內的遊離循環DNA中存在雜合性丟失（loss of heterozygosity, LOH）和基因啟動子區的甲基化^[91]，這一發現說明遊離循環DNA也許可以用於判斷個體是否存在發生肺癌的風險。

2.2.3 靶向藥物耐葯監測 

        眾所周知，存在驅動基因突變的NSCLC患者需接受相應的靶向治療。但是，目前的靶向治療藥物，無論是EGFR還是ALK抑製劑均會在10個月左右出現耐葯^[7,92]，與此同時對於這部分患者耐葯的準確判定，實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）可能並不完全適用^[93]。另一方面，酪氨酸結構域的二次突變是導致酪氨酸激酶抑製劑耐葯的重要原因之一^[7]。因此，通過ctDNA檢測獲得性耐葯基因的表達，成為了目前研究的重點方向之一。

        2013年，Murtaza等^[94]在Nature雜誌上發表了其利用血漿DNA檢測觀察腫瘤治療後獲得性耐葯的研究。其動態觀察了6例腫瘤患者（２例乳腺癌、２例卵巢癌、２例肺癌）接受相應治療後的1年-2年時間中，外周血DNA腫瘤突變數量的變化。結果發現，外周血中突變負荷的增加與治療的耐葯密切相關。其中一例接受吉非替尼治療的患者在耐葯時外周血中檢出了T790M突變。在接受EGFRTKIs治療的EGFR突變患者中，ctDNA中檢測T790M突變的技術方法較為普遍。而且，2015年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年會中口頭報告了ctDNA中T790M突變與三代EGFR-TKIs Rociletinib治療之間的關係，存在T790M突變患者的有效率為53%，疾病控制率為82%，兩者具有明確的相關性^[95]。2015年發表在Nature Medicine中關於三代EGFR-TKIs耐葯機制的研究報道，更是提示ctDNA檢測在這一方面的前景。該研究通過隨訪15例T790M突變的患者接受AZD9291治療，動態監測ctDNA，發現並證實了AZD9291獲得性耐葯的突變位點C797S^[96]。並且通過動態觀察，發現AZD9291存在三種耐葯模式 ，一種是耐葯後T790M突變與C797S突變同時存在，一種是耐葯後僅出現T790M的再次升高，第三種是耐葯後即不伴有T790M也無C797S的出現。

3 小分子RNA（mircoRNA, miRNA）和長鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA）

        在生物基因組中 廣泛存在一類非編碼蛋白的RNA基因，其轉錄物在某種機制下被加工成長度大約20個-24個核苷酸的小RNA，他們因此被命名為miRNA。這類RNA表達譜可以作為某些組織或細胞的特異性分子標誌，具有調節其他基因表達的活性，在生物發育過程中發揮著重要的作用。

        至今為止，真正確認功能的miRNA還是微乎其微，雖然現在已經找到了1,000個以上miRNA，並提出他們在細胞增殖、分化、代謝與死亡中發揮著重要的調節作用。Lin-4、Let-7的靶基因是ras信號通路的蛋白^[97-99]；Lin-41、hbl-1、Lin-14和Lin-28調控時序發育^[100]等。

        長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子，他可在多層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄後調控等）調控基因的表達。lncRNA最初被認為是RNA聚合酶II轉錄的副產物，是一種「噪音」，不具有生物學功能。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等過程，越來越多的人正在研究其調控作用^[101]。

4 小結

        通常來說，保證特異性前提下的高敏感度、便於臨床應用、可重複性好是CTC與ctDNA檢測技術的三個重要評判標準。較高敏感度可保證在數以億計的背景細胞或者基因組中有效檢出CTC或者ctDNA；便於臨床應用是考慮該技術應用於臨床的便利性（如檢測時間、價格、所需樣本大小等）；可重複性則保證了臨床應用的可靠性。因此，從科研探索走向真正的臨床應用前，「液態活檢」^[102]的各項檢測技術需要通過大規模的臨床數據進行驗證。否則，只能限制用於科研探索。

        CTC和ctDNA仍有不少問題值得我們去探索。關於CTC，外周血中的CTC大部分為具有轉移傾向的，對其分子生物學特徵的理解有助於我們探索腫瘤發生髮展的機制；CTC的富集技術已經日趨成熟，通過高效的富集方法，能否通過病理學手段對循環中的腫瘤細胞進行病理學判定，有助於我們對患者進行真正的無創「液態活檢」。關於ctDNA，ctDNA中檢測出的基因變異（EGFR或者ALK）是否可以直接指導臨床治療，我們需要進一步的數據來證實；EGFR突變患者使用靶向治療耐葯的過程中，RECIST標準往往評價不夠完整，如何通過血液監測耐葯突變（T790M）的丰度來指導我們的耐葯，也非常值得臨床探索。

        在將來，隨著我們檢測方法的不斷進步，期待液態活檢技術能夠真正應用到臨床，指導肺癌精準治療，成為延長患者生存期的必備手段！

詳見《中國肺癌雜誌》2 0 1 5年1 2月第1 8卷第1 2期 Chin J Lung Cancer, December 2015, Vol.18, No.12

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