專題1　基因工程　知識系統表解

DNA重組技術的基本工具DNA重組技術的基本工具限制性核酸內切酶―「分子手術刀」來源主要從原核生物中分離純化出來。種類已從近300種不同的微生物中分離出約4000種限制酶。作用內容及特點識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列（大多數識別序列由6個核苷酸組成，如EcoRI、SmaI；也有少數識別序列由4、5或8個核苷酸組成），並使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，參見教材圖1-2，即具有特異性。結果切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式（參見教材圖1-3）：①黏性末端：在識別序列中軸線兩側切開②平末端：在識別序列中心軸線處切開DNA連接酶―「分子縫合針」作用將雙鏈DNA片段「縫合」起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。種類種類來源作用E·coliDNA連接酶大腸桿菌只能連接互補的黏性末端。T4DNA連接酶T4噬菌體連接互補的黏性末端和平末端（效率低）。基因進入受體細胞的載體―「分子運輸車」舉例質粒（常用）概念是一種裸露的、結構簡單、獨立於細菌染色體（即擬核DNA）之外，並具有自我複製能力的雙鏈環狀DNA分子。特點●具有一個至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入其中；●可在受體細胞中自我複製或整合到染色體DNA上進行同步複製；●具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。其它λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。作用將外源基因送入細胞。模擬製作目的要求詳見教材相關內容。材料用具詳見教材相關內容。方法步驟1.製作個DNA片段：詳見教材相關內容。2.切割：詳見教材相關內容。3.拼接：詳見教材相關內容。基因工程的基本操作程序目的基因的獲取從基因文庫中獲取基因文庫概念將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。類型基因組文庫和部分基因文庫（如cDNA文庫）：詳見表1-2-1。獲取方法根據目的基因的有關信息（例如根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因翻譯的產物蛋白質等特性）來獲取目的基因。利用PCR技術擴增含義PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。是一項在生物體外複製特定DNA片段的核酸合成技術。原理是利用DNA雙鏈複製的原理，將基因的核苷酸序列不斷地加入複製，使其數量呈指數方式增加。過程①目的基因DNA受熱解為單鏈；②引物與單鏈相應互補序列結合；③在DNA聚合酶作用下延伸形成新基因；④重複循環多次，基因數目以指數形式擴增。如教材圖1-8。用化學方法人工合成適用範圍基因比較小，核苷酸序列已知的基因；儀器可用DNA合成儀人工合成。基因表達體的構建（核心）目的使目的基因在受體細胞中穩定存在，並可遺傳給下一代；使目的基因能夠表達和發揮作用。組成啟動子位置基因的首端作用是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需蛋白質。目的基因終止子位置基因的尾端作用使轉錄在所需要的地方停止下來。標記基因作用鑒別、篩選受體細胞中的目的基因。舉例抗生素基因構建方法因受體細胞（植物、動物、微生物）不同，目的基因導入受體細胞的方法不同而有所差別。將目的基因導入受體細胞方法植物細胞轉化的概念目的基因進入受體細胞內，並且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。農桿菌轉化法(常用)農桿菌存在生活在土壤中特點能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物無感染能力。原理植物傷口處細胞分泌的酚類化合物吸引農桿菌移向這些細胞，使其Ti質粒上的T-DNA轉移至受體細胞並整合到受體細胞的染色體DNA上。方法將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌轉化作用進入植物細胞並插入到染色體DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達優點比較經濟有效，約80%轉基因植物通過這種方法獲得。基因槍法和花粉管通道法：詳見教材中的【生物技術資料卡】動物細胞顯微注射技術：①將含目的基因的表達載體提純，並使DNA濃度保持在1～3μg/mL；②從雌性動物體內取出卵（可體內或體外受精），進行顯微注射；③將注射了目的基因的受精卵移植到雌性動物的輸卵管或子宮內，發育成具有新性狀的動物。微生物特點繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少。方法用Ca2+處理細胞（這種細胞稱為感受態細胞），將重組表達載體DNA分子溶於緩衝液中與感受態細胞混合，在一定溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子。目的基因的檢測與鑒定分子檢測目的基因是否插入到轉基因生物染色體上意義目的基因能否在真核細胞中穩定遺傳的關鍵方法DNA分子雜交技術：①提取轉基因生物的基因組DNA；②用放射性同位素標記含目的基因的DNA片段作探針；③與基因組DNA雜交；④若顯示出雜交帶就表明目的基因已插入染色體DNA中。如教材圖1-14。目的基因是否轉錄成mRNA意義是檢測目的基因是否發揮功能作用的第一步方法DNA分子雜交技術：①從轉基因生物中提取mRNA；②同樣方法標記目的基因作探針；③與mRNA雜交；④若顯示出雜交帶就表明目的基因轉錄出mRNA。目的基因是否翻譯成蛋白質從轉基因生物中提取蛋白質；用相應的抗體進行抗原─抗體雜交；有雜交帶表明目的基因已形成蛋白質。個體生物學水平鑒定：如抗蟲或抗病性狀的接種實驗；與天然產品的功能活性比較等。表1-2-1 基因文庫的類型：文庫類型基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）構建方法將某種生物體內的DNA全部提取出來，選用適當的限制酶，將DNA切成一定範圍大小的DNA片段，分別與運載體連接，導入受體菌群體中儲存，每個受體菌中都含有一段不同的DNA片段。用某種生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接後儲存在一個受體菌群中。文庫大小大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）有無基因中內含子（位於編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段）有無基因多少某種生物的全部基因某種生物的部分基因物種間的基因交流部分基因可以可以基因工程的應用植物提高農作物的抗逆能力抗蟲轉基因植物傳統防蟲方法大多是依靠化學農藥危害造成環境污染損害人類健康增加成本發展趨勢—轉基因抗蟲植物成果水稻、棉、玉米、馬鈴薯、番茄、大豆、蠶豆、煙草、蘋果、核桃、楊、菊花和白花三葉草等。殺蟲基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑製劑基因、澱粉酶抑製劑基因、植物凝集素基因等。我國成就我國轉基因抗蟲棉就是轉入Bt毒蛋白基因培育出來的，它對棉鈴蟲具有較強的抗性。抗病轉基因植物病原微生物含義引起植物生病的微生物稱為病原微生物。類型主要有病毒、真菌和細菌等。成果已獲得抗煙草花葉病毒的轉基因煙草和抗病毒的轉基因小麥、甜椒、番茄等多種作物。採用的基因抗病轉基因植物使用最多的是病毒外殼蛋白基因和病毒的複製酶基因；抗真菌轉基因植物中可使用的基因有幾丁質酶基因和抗毒素合成基因。其他抗逆轉基因植物造成低產、減產的常見因素鹽、鹼、干早、低溫、澇害等不利的環境條件成果正在研究提高農作物的抗鹽鹼和抗乾旱能力。開發出了耐寒作物。抗除草劑的大豆、玉米等作物的研究。改良植物的品質食品營養問題人們對食品的要求是吃飽且要富於營養。許多食品含有的營養成分並不平衡。措施將必需氨基酸含量多的蛋白質編碼基因導入植物中，或者改變這些氨基酸合成途徑中某種關鍵酶的活性，以提高氨基酸的含量。成果我國科學家將富含賴氨酸的蛋白質編碼基因導入玉米，玉米中賴氨酸的含量比對照提高30％。延長番茄貯存期我國科學家將控制番茄果實成熟的基因導入番茄，獲得轉基因延熟番茄，儲存時間可延長l～2個月，有的可達80多天。花卉的觀賞價值我國科學家還成功地將與植物花青素代謝有關的基因導入花卉植物矮牽牛中，轉基因矮牽牛呈現出自然界沒有的顏色變異，大大提高了花卉的觀賞價值。動物品種改良提高生長速度方法將外源生長激素基因導入動物體內，以提高動物的生長速率。舉例轉基因綿羊的生長速率比一般的綿羊提高30％，體型增大50％；9個月後有的轉基因鯉魚比對照重1.5kg。改善畜產品品質將腸乳糖酶基因導入奶牛基因組獲得的轉基因牛分泌的乳汁乳糖的含量大大減低。用轉基因動物生產藥物－生物反應器乳腺生物反應器或乳房生物反應器科學家將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導入哺乳動物的受精卵中，然後將受精卵送入母體內，使其生長發育成轉基因動物。轉基因動物進入泌乳期後，可以通過分泌的乳汁來生產所需要的藥品。成果已在牛和山羊等動物乳腺生物反應器中表達出了抗凝血酶、血清白蛋白、生長激素和α—抗胰蛋白酶等重要醫藥產品。作器官移植的供體科學家正試圖利用基因工程方法對豬的器官（由於豬的內臟構造、大小、血管分布與人極為相似，而且豬體內隱藏的、可導致人類疾病的病毒要遠遠少於靈長類動物）進行改造，採用的方法是將器官供體基因組導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因，再結合克隆技術，培育出沒有免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官。基因工程藥品第一種基因工程藥物重組人胰島素成果利用轉基因的工程菌生產的藥物已有60多種。這些藥物包括細胞因子、抗體、疫苗、激素等。這些藥物可以用來預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕等疾病。我國成就白細胞介素—2、干擾素、乙肝疫苗等近20種基因工程藥物投放市場，年產值達30億元人民幣。舉例干擾素的生產（化學本質、作用、傳統生產方法）基因治療概念基因治療是把正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能，從而達到治療疾病的目的。意義這是治療遺傳病的最有效的手段舉例：複合型免疫缺陷症疾病類型是一種遺傳疾病病因由於腺苷酸脫氨酶基因缺失，造成體內缺乏腺苷酸脫氨酶（腺苷酸脫氨酶是人體免疫系統發揮正常功能作用所必需的）。治療將腺苷酸脫氨酶基因轉入取自患者的淋巴細胞中，使淋巴細胞能夠產生腺苷酸脫氨酶，然後，再將這種淋巴細胞轉入患者體內。方法體外基因治療方法先從病人體內獲得某種細胞，例如T淋巴細胞，進行培養，然後，在體外完成基因轉移，再篩選成功轉移的細胞擴增培養，最後重新輸入患者體內。特點大部分基因治療的臨床試驗方法；方法操作複雜，但效果較為可靠。體內基因治療方法直接向人體組織細胞中轉移基因的治病方法舉例1994年美國科學家利用經過修飾的腺病毒作載體，成功地將治療遺傳性囊性纖維化病的正常基因轉入患者肺組織中。特點簡便問題及展望問題處於初期的臨床試驗階段。可以說，在沒有完全解釋人類基因組的運轉機制，充分了解基因調控機制和疾病的分子機理之前，進行基因治療是十分困難的。存在技術、倫理道德以及安全性方面的諸多困難。展望如果這些問題能逐一解決的話，基因治療將推動21世紀的醫學革命。蛋白質工程產生(崛起)基礎基因工程緣由內容基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質，這些天然蛋白質是生物在長期進化過程中形成的，它們的結構和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產和生活的需要。舉例利用蛋白質工程延長干擾素的保存時間；利用蛋白質工程提高玉米中賴氨酸的含量；許多工業用酶改變天然酶的特性後，使之適應生產和使用需要。基本原理流程預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）→合成DNA→表達出蛋白質，參見教材圖1-29。內容(概念)蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關係作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或製造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求（即基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程領域）。進展和前景前景極為廣闊，如：科學家通過對胰島素改造使其成為速效型藥品。正積極探索將蛋門質工程應用於微電子方面（用蛋白質工程方法製成的電子元件，具有體積小、耗電少和效率高的特點）。進展內容難度大，成功的例子不多。原因蛋白質的高級結構複雜，了解不夠。展望隨著科學技術的深入發展，蛋白質工程將會給人類帶來更多的福音。2
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