腫瘤液體活檢技術：CTC和ctDNA孰優孰劣？
05-29
如果醫生想深入了解腫瘤，他們的選擇很有限。他們可以掃描相關區域、採集組織活檢，或監控血液的標誌物，如PSA或CA 125。不過，這些都不太理想：成像的解析度不高，活檢是侵入性的，而良好的標誌物是少之又少。最理想的情況是，研究人員能通過簡單的血液檢測來實現組織活檢的敏感性和特異性。如今，液體活檢的出現，讓這一切成為可能。液體活檢據斯坦福大學醫學院的助理教授Max Diehn介紹，就傳統的癌症標誌物而言，普遍的問題是特異性。「對於之前探索的大多數生物標誌物，正常細胞也會產生，因此並不是腫瘤細胞所獨有的。這意味著，它們往往不是很特異。」液體活檢則通過搜索血液及其他體液中更加特異的腫瘤指紋，來克服這方面的缺陷。這些指紋有兩種形式：循環腫瘤細胞（CTC）是從腫瘤上脫落的活細胞，可能代表了轉移的種子；循環腫瘤DNA（ctDNA）則是來自死細胞的遺傳物質，通常以DNA短片段的形式存在。Diehn實驗室最近介紹了一種檢測非小細胞肺癌患者血液中的ctDNA的方法，這些片段的平均長度為170 bp 。
當然，正常細胞也存在於血液中，而且每天都有正常細胞死亡。因此，無論研究人員是尋找CTC還是ctDNA，他們都必須慧眼識珠。對於CTC，這通常是藉助細胞表型來實現的，如利用Janssen Diagnostics的CELLSEARCH分析，它根據上皮細胞標誌物的表達來選擇細胞。
對於ctDNA，研究人員必須根據它們的序列來挑出片段，這是個艱巨的任務，因為沒突變的DNA不能提供信息。因此，這項技術適用於突變已知的情況。例如，Diehn開始鑒定NSCLC患者中常常突變的基因組區域，生成CAPP-Seq selector文庫。這個寡核苷酸集合代表了139個基因的521個外顯子和13個內含子。研究小組利用它來收集血漿中的互補DNA片段，並以高覆蓋度測序。根據2014年約翰霍普金斯大學醫學院的研究，ctDNA可在各類腫瘤患者的血漿或血清中發現，不過隨著腫瘤位置和分期的不同，分析的敏感性也有差異。「75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等癌症患者中可檢測到ctDNA，不過對於原發性腦癌、腎癌、前列腺癌或甲狀腺癌，檢測率不到50%，」作者寫道。約翰霍普金斯大學的腫瘤學教授Nickolas Papadopoulos表示，研究人員可以通過靠近源頭來實現更高的敏感性，比如，在檢查泌尿生殖系統腫瘤時檢測尿液，或在檢查頭頸部癌症時檢測唾液。實際上，研究小組最近發現通過腦脊液檢查，使得中樞神經系統的腫瘤檢測有所改善。如同許多ctDNA研究一樣，霍普金斯的團隊也使用靶向測序來檢測ctDNA。在這種情況下，一種稱為Safe-SeqS的條形碼策略可準確報告樣本中的ctDNA分子數量。研究人員也可以利用數字PCR來定量具體的變化，不過有的作者指出，「數字PCR分析提供了高的準確性和靈敏度，但需要個性化分析的設計，這是限速步驟」。有利有弊研究人員檢測癌症患者的血液及其他體液中的ctDNA，使其成為一種有潛力的生物標誌物。然而，據Papadopoulos介紹，ctDNA不僅僅是指標，似乎還與「腫瘤負荷」有關，其水平隨疾病嚴重程度而升高。此外，一些早期的癌症也能檢測到ctDNA，表明不僅可使用ctDNA來監控現有的癌症，還能作為篩查工具。美國國家癌症研究所淋巴治療科的科長Wyndham Wilson表示，ctDNA還能用於預測腫瘤的複發。在一項瀰漫性大B細胞淋巴瘤的研究中5，ctDNA能夠在CT掃描前幾個月就發現腫瘤複發。因此，醫生能夠更早治療患者，改善他們的長期預後。然而，ctDNA作為篩查工具，也面臨一些潛在的問題。目前還不清楚ctDNA在不同的癌症類型、分期和患者中的普遍程度。即使檢測到ctDNA，也不清楚是體內哪裡產生的，或者即使檢測到的突變與腫瘤存在一定關聯，也需要後續檢測。相比之下，CTC分析能提供基因組完整的活細胞。因此，研究人員可分離出這些細胞，在顯微鏡下觀察它們，並研究每個細胞的基因組和蛋白表達。Aviva Biosciences公司的研發副總裁Antonio Guia認為，這帶來了比ctDNA分析更廣譜的方法，因此你不必看特定基因的特定片段。
最近，哈佛大學的Daniel Haber及其同事就開展了一些研究，利用單細胞RNA-Seq來鑒定單個前列腺癌CTC的信號差異，並將這些差異與治療反應相關聯6。研究小組利用一種稱為CTC-iChip的微流體設備來分離CTC，它根據CD45或CD66的表達將CTC與其他血細胞分離。不過，對於液體活檢而言，問題並不在於選擇CTC還是ctDNA。Janssen Diagnostics的首席醫療官Jorge Villacian認為，兩種標誌物能提供互補的信息，作為臨床工具都有市場。這家公司專註於CTC診斷。「腫瘤醫生以及監管部門對液體活檢的概念了解得越多，對每個人都是雙贏的 – 對患者、對醫生以及對制度本身，因為這將使得發病率更低、併發症更少，並改變早期治療，對患者有利。」小知識：ctDNA是什麼癌細胞在破裂和死亡時，會釋放出循環腫瘤DNA（ctDNA）等內容物，這種ctDNA是飄浮在血液中的基因組片段。細胞殘骸一般由清道夫細胞（如巨噬細胞）清除，然而腫瘤很大細胞增殖又很快，導致清道夫細胞應付不過來。對血液中的腫瘤DNA進行檢測和測序，可以幫助人們通過取血得到更全面的癌症信息，告訴醫生治療是否已經起作用，腫瘤有沒有演化出抗性。當然這一技術的應用也面臨著一些問題。舉例來說，不同人的ctDNA水平差異較大，而且ctDNA並不那麼容易檢測，特別是在腫瘤的早期階段。另外，人們還需要在更大型的研究中進行驗證，看ctDNA是否給出了足夠準確的信息。如果能夠克服上述障礙，醫生們將能根據ctDNA進行更好的治療，隨著癌症的演化調整治療策略，Johns Hopkins大學的Victor Velculescu說。「這種技術可以幫助人們最終實現個性化醫療，為癌症領域帶來一場新的變革。」ctDNA發展簡史1948年科學家們首次發現人體血液中存在著循環DNA，癌症患者的循環DNA則發現於1977年。在那之後又過了17年，人們才發現這些DNA含有癌症的標誌性突變，說明它們來自於腫瘤。
最開始，循環DNA的實際應用並不在癌症領域。鑒於腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學的盧煜明（Dennis Lo）教授推測胎兒DNA應該也能進入血液。1997年他向人們成功展示，孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。這一發現允許醫生們在懷孕初期通過無創方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合症等發育疾病。這是產前診斷領域的一次革命。「癌症研究後來才跟上進度，」英國癌症研究所Nitzan Rosenfeld說。這是因為腫瘤DNA比胎兒DNA更難檢測，而且早期的測序技術還不夠準確可靠。近十年來隨著技術的進步，DNA檢測技術已經足夠靈敏。舉例來說，BEAMing擴增法可將循環DNA連在磁珠上，然後進行分離和計數。即使健康細胞DNA與ctDNA的比值達到10,000：1，BEAMing擴增法也可以有效檢測出ctDNA來。BEAMing擴增法是JohnsHopkins大學的Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler開發的。2007年，他們用這一技術對18名腸癌患者的ctDNA進行了跟蹤。手術後這些患者的ctDNA水平下降了99%，其中許多患者的ctDNA並沒有完全消失。研究顯示，手術後仍檢測得到ctDNA的患者，基本上都出現了癌症複發。但手術後沒有檢測到ctDNA的患者，腸癌並沒有複發。這說明ctDNA能夠展現患者對手術的應答情況，告知醫生他們是否需要進行化療。研究者們很快也在其他癌症類型中得到了類似的結果。Rosenfel等人發現，ctDNA能夠提供晚期卵巢癌和乳腺癌的準確信息。而Diaz等人在至少75%的晚期腫瘤患者中檢測了ctDNA，涉及了多種器官，比如胰腺、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。（腦癌除外，因為血腦屏障使腫瘤DNA無法進入血液。）ctDNA有何優勢循環DNA將比人們幾十年來鑒定的蛋白指標更加好用，因為ctDNA檢測很少有假陽性。此外，ctDNA半衰期只有不到兩小時，而絕大多數蛋白指標能在血液中存在幾個星期，可見ctDNA能更清晰的反映腫瘤的當前信息。有研究表明，在檢測乳腺癌和腸癌時，ctDNA比蛋白質指標更靈敏，還可以跟蹤腫瘤的消失、擴散和複發。血液中的循環腫瘤細胞也是癌症研究的一大熱點。不過，ctDNA比循環腫瘤細胞還要靈敏，數量也更多，更適合成為癌症的生物學指標。ctDNA的最大優勢在於，能夠對腫瘤的演化和適應性改變進行監控。這樣的研究可以回答許多困擾科學家多年的問題，比如，為何那麼多靶向性治療都以失敗告終，癌症是怎樣發展出抗性的等等。EGFR在細胞生長和分裂中起到了重要的作用，在癌細胞中特別活躍。Gefitinib和panitumumab是阻斷EGFR的抗癌藥物，這些藥物起初都能有效治療患者。但幾個月後，癌症就會通過其他基因突變（例如KRAS）對它們產生抗性。
要監控患者的癌症發展，醫生們目前得進行多次活檢，以決定下一步的治療策略。然而癌症晚期患者通常有好幾個需要檢測的腫瘤，單個腫瘤中也可能存在不同的抵抗機制。更重要的是，活檢有一定的風險性，難以用於肺部等脆弱的器官。相比之下，血檢就容易多了。2012年，Diaz研究團隊對接受EGFR抑製劑治療的患者進行ctDNA分析。他們發現了42種與癌症抗性有關的KRAS突變，利用這些突變可以比傳統方法早五個月發現腫瘤的變化。Rosenfeld團隊則收集了六名晚期乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者的血樣，並且進行了完整的外顯子組測序。他們由此揭示了癌症抗性的發展路徑，例如癌細胞出現突變，阻止藥物與其目標結合。如果醫生們能夠及時發現癌症的抗性，就可以早點停用已經不起作用的昂貴藥物。研究癌症抗性背後的突變，還有助於開發更有效的癌症療法或者藥物組合。「我們的目標是將癌症從一種致命疾病轉變為一種慢性病，」 Velculescu說。「當治療不起作用時，可以換用其他的治療途徑。」科學家們逐漸發現，腫瘤有著很高的異質性，標準程序（tissue biopsy）根本不足以判斷癌症的預後情況。而且活檢得到的是靜態信息，無法準確反映癌症的演化。在這種情況下，ctDNA就成為了科學家們的新希望，它能為人們揭示更多的癌症信息，甚至跟蹤癌症的發展。如果能夠得到充分利用，血液循環中的腫瘤DNA將為癌症治療帶來一場變革。理想與現實潛力巨大，但目前ctDNA還無法成為臨床上的主要診療手段。這是因為，最靈敏的ctDNA檢測（例如BEAMing）需要事先知道想要檢測的突變，但獲得這樣的信息又相當麻煩。外顯子組測序不需要預先知道任何信息，但檢測罕見突變的需求深度測序，這樣做的成本非常高。斯坦福大學的MaximilianDiehn決定將上述兩種方法的優點結合起來。他的研究團隊發現，基因組有一小部分（僅0.004%）在肺癌中反覆突變。在獲得患者血樣之後，對這一部分進行深度測序，能夠以低廉的成本檢測罕見突變。目前，該團隊正在嘗試將類似技術用於其他類型的癌症，並在臨床試驗中加以驗證。幾乎所有的活檢技術，都不能很好的檢測早期癌症。ctDNA在一項研究中檢測出了所有II級以上的肺癌，但只檢測出了一半的I級腫瘤，這多半是因為晚期癌症能釋放出更多的DNA。這個問題無意會限制ctDNA在癌症篩查中的應用。在ctDNA走入臨床之前，還有一些其他的問題有待解決。例如，ctDNA是否能真實反映癌症的特徵？轉移瘤是否和原發瘤釋放同樣多的DNA？Diaz指出，人們需要在患者死後快速對所有腫瘤取樣，將其與患者生前的ctDNA進行比較。「這將是一項艱巨任務，」他說。
ctDNA提供的信息是否真的能夠挽救患者生命或者提高他們的生活質量呢？「光監控腫瘤是不夠的，」Johns Hopkins大學的腫瘤學家Luis Diaz說。「實際應用才是我們面臨的真正挑戰。」目前，癌症的靶向性治療還遠遠跟不上科學家們的癌症研究。如何將研究成果轉化為醫療進步，這也是ctDNA研究中最現實的一個問題。ctDNA可能一時半會兒還無法決定癌症的治療，不過它仍不失為一個寶貴的研究工具。越來越多的醫生正在把ctDNA採集列入自己的常規操作中。小知識：CTC1.循環腫瘤分子特徵分析英國癌症中心發表在NatureReviews上的綜述，全面的介紹了CTC經歷EMT機制入血到形成轉移灶的過程中CTC的分子特徵的的變化。Matthew G. Krebs指出：CTC分析技術可以用於評估腫瘤異質性和疾病進程，在治療過程中，身體中占支配地位的CTC是不斷變化的，伴隨治療耐葯的出現，耐藥性CTC逐漸在治療後增多。CTC的分析可以通過動態監測腫瘤細胞的變化，實時、動態的反映患者的治療狀況及疾病進程，為目前的腫瘤治療監測提供很好的補充。2.CTC培養用於藥物敏感性試驗哈佛醫學院的研究人員發表在science上發表的一項研究，研究通過體外培養循環腫瘤細胞，並將其用於基因測序和藥物敏感試驗。哈佛醫學院的Daniel Haber從36個患者樣本中分離出了CTC細胞，並通過體外培養建立了細胞系。這些細胞系完整的保留了原始的細胞形態和特徵，動物試驗顯示這5個CTC細胞系中有3個檢測到小鼠致瘤。研究人員藥物敏感性試驗發現CTC藥物敏感性測量結果與臨床病史一致，包括紫杉醇和卡培他濱的敏感性、氟維司群和阿黴素的耐藥性。隨著CTC培養條件的優化，這個策略可以幫助惡性腫瘤患者在整個疾病過程中接受最好的治療。
3.循環腫瘤胞團由哈佛大學完成的一項關於循環腫瘤細胞團的研究發表在cell，該項研究中研究人員通過示蹤標記乳腺腫瘤的小鼠模型，發現CTC細胞團是由單克隆腫瘤細胞群形成而不是在血液循環中聚集形成。雖然血液中CTC細胞團相對單個CTC而言較為稀少，但是其形成轉移的潛能是單個CTC的20~50倍。該項研究說明循環腫瘤細胞團有更大的轉移潛能，是單個CTC轉移潛能的20~50倍。4.CTC表型和核型分析的臨床意義由北京大學腫瘤醫院完成的一項關於循環腫瘤細胞表型和核型分析的研究發表在Oncotarget，研究人員通過陰性富集技術結熒光原位雜交技術檢測CTC，進一步分析胃癌CTC中人表皮生長因子受體（HER2）表達及8號染色體非整倍體。該項研究結果顯示CTC水平的HER2檢測與靶向治療用藥相關，CTC核型分析表明8號染色體不同倍體對於紫杉醇、順鉑化療敏感或耐葯存在相關性。根據CTC 8號染色體核型或者HER2 表達可以監測胃癌患者化療耐葯以及評估治療療效。
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