【小鼠大學問】2分鐘讓你看懂小鼠模型定製方案

終於下定決心要做一個基因敲除小鼠模型啦！恭喜你邁出了重要的一步！

可是怎麼看我的小鼠模型定製方案呢？一份合格的定製方案應該是什麼樣的呢？

看完下面的介紹你就明白啦！

一份基因工程小鼠定製方案一般需要包括以下幾方面內容：

• 定製目的
• 目的基因信息
• 模型構建策略
• 定製周期
• 風險提示

定製目的

在進行方案分析前，首先我們需要清楚地了解你的需求以及目的。例如：我需要一個 Atg5 基因的條件性基因敲除小鼠來研究自噬。

靶基因信息

接下來我們就會針對你感興趣的靶基因，例如 Atg5 基因，來進行分析啦：

Atg5 基因在小鼠中的基因全名是 autophagy related 5，染色體位置是位於小鼠10號染色體，全長約96kb。

目前一共發現了兩個轉錄本，分別為 Atg5-201 和 Atg5-202。其中202號轉錄本不編碼蛋白；僅201號轉錄本編碼功能蛋白產物，最終翻譯成含有275個氨基酸的 Atg5 蛋白。

Atg5-201號轉錄本共有8個外顯子（exon），翻譯起始於第2個外顯子中的起始密碼子，終止於第8個外顯子。在第7個內含子（intron）中還包含一個microRNA，Mir1929。

我們還會查詢這個基因是否已經有 KO 或 CKO 的小鼠模型被文獻報道過，以及它們的敲除策略是什麼，有什麼顯著的表型。

比如，已經被報道的 Atg5 基因敲除小鼠模型有：

現有 Atg5 CKO 小鼠模型的敲除策略：

A targeting vector was designed to flank exon 3 with loxP sites. A neomycin resistance cassette was included such that expression of cre recombinase would remove both exon 3 and the neo. （Reference：Hara T, et al., Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature. 2006 Jun 15;441(7095):885-9）

敲除或突變小鼠的已知表型有：

Mutation of this gene results in impaired autophagy due to absence of autolysosomes. Homozygotes die within 1 day of birth, have shorter survival times and reduced amino acid levels under fasting conditions. Homozygotes for a gene trap insertion mutationin this gene show no abnormal phenotype.

等一下，這些信息是從何而知的？3個神奇的網站：NCBI、Ensembl、MGI

模型構建策略

重頭戲來啦！定製策略是怎麼確定的？

要敲除 Atg5 基因，我們可以選擇 exon3 作為敲除區域，這與已經報道的 CKO 模型不謀而合。

為什麼選 exon3 呢？

來看看 Atg5 基因的具體外顯子序列信息吧。

Atg5 起始密碼子位於 exon2，而 exon3 是其後第一個不為3的整數倍的外顯子（也就是說假設敲除 exon3 會導致 Atg5 的讀碼框發生移碼突變，使翻譯提前終止），而且 exon3 兩側的 intron 長度也適合 loxp 位點的插入。

如果靶基因沒有會導致移碼突變的 exon，那麼可以選擇敲除之後能移除重要結構域的 exon，從而實現蛋白突變。

決定了 Atg5 exon3 作為我們 flox 的區域後，我們會根據敲除後的剩餘外顯子序列推測出仍可能翻譯出來的突變蛋白氨基酸序列，以供參考。

不過這個預測的突變蛋白是否具有功能，我們也無法預知呢。

Atg5 CKO 整個 flox 區域大約將有0.7kb，我們可以採用周期更短、費用更低的 Crispr-Cas9 技術來製備這個 CKO 模型。接著我們就要針對 loxp 位點將要插入的序列（intron2 和 intron3）來設計 guideRNA，並繪製打靶策略圖。

如果 flox 區域非常龐大或需要重組的結構非常複雜，我們會建議採用 ES 細胞打靶的方式。

定製周期

然後就要告訴你完成這個小鼠模型的定製大約需要多少時間，也就是定製的周期。Crispr-Cas9 途徑的定製周期一般為以下表格所示：

而 ES 細胞打靶途徑的定製周期如下：

風險提示

方案中還有一部分內容提示了這個小鼠模型在構建策略、技術路線等方面可能存在的風險或難點。預先了解風險也很重要哦！

比如：

loxp 位點插入的位置是否對基因外顯子剪接有影響？

敲除的區域是否包含了其它基因的編碼或調控區域？

基因敲除或突變後是否可能發生胚胎致死？

等等等等...

這樣，一份基因工程小鼠模型定製方案就完成啦！你get到了么？

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