學習與記憶（四）：記憶分子機制的系列經典研究（上）

來自專欄 少女科學家

（找不到封面配圖了，請大家賞花_(:з」∠)_。新鮮的，周末才拍出來的。）

1992～2002年間發表在Science和Nature上的一系列研究向人們揭示了CaMKII蛋白在學習和記憶中起到的作用。下面將回顧其中的幾篇文章。

在1992年之前，研究者們就猜想，LTP可能是一種學習機制。當時支持這種猜想的證據只有一條，即阻斷NMDA受體會導致空間學習能力受損。但是這條證據是有問題的，因為阻斷NMDA受體會導致突觸功能缺陷，從而干擾海馬迴路的功能。為了解決這個問題，Sliva等人想要在保持突觸功能正常的情況下減少對突觸激活水平，從而檢驗是否能消除LTP。而αCaMKII是一個被發現只存在於神經系統中的蛋白激酶，且它一旦自我磷酸化後就不再依賴於Ca+/CaM；一些學習模型中也發現了這種機制。也就是說，αCaMKII可能與LTP有關。

提一句，1992年7月的Science雜誌被Sliva的組霸刊了，連發了兩篇文章。一篇講基因變異模型及細胞水平上進行的模型檢驗，一篇專門講行為學水平上的模型檢驗。鑒於後者比較容易理解， 這裡主要聚焦於第一篇文章。

老師說，現在想要發Science，可沒那麼容易了，醒醒吧別睡了。

1）αCaMKII變異模型

研究者採用基因打靶（gene target）技術在αCaMKII基因序列上的調節域中敲入一個抗新黴素的 neo 基因。這樣一來，αCaMKII基因就無法正常表達出蛋白質了。

打靶載體通過電轉移法 (electroporation) 被導入囊胚的胚胎幹細胞。由於打靶載體帶有抗新黴素的 neo 基因，整合了打靶載體的胚胎幹細胞能夠在有新黴素（neomycin）的環境中生長，繼而被篩選出來。之後，這些幹細胞打回囊胚中。

為了檢驗是否完全乾擾了αCaMKII基因、阻斷了其轉譯和表達，研究者先後做了南方檢驗（Southern analysis/blot）、西方檢驗（Western analysis）和北方檢驗（Northern analysis）。南方檢驗是對DNA的檢驗。

南方檢驗是對DNA的檢驗。上圖是對野生型、變異雜合子和變異純合子的DNA檢驗。Kb表示的是鹼基對的多少。從圖中可以看到，野生型只有單一鹼基對長度的鏈；變異雜合子有一條和野生型一樣長的鏈，還有兩條短鏈；變異純合子只有兩條短鏈。這是因為變異鏈上新打入的neo基因帶有限制性內切酶Pvu II的一個剪切位點，所以Pvu II可以在變異鏈的中間多咔嚓一刀，把一條長鏈變成兩條短鏈。顏色的深淺與檢驗樣本的質量大小有關。

北方檢驗是對RNA進行分析。既然已經沒有原表達基因了，DNA自然無法轉譯，為什麼還要進行RNA分析？研究者是為了確認沒有DNA殘鏈被轉譯成了RNA（有可能殘鏈轉譯的RNA也會被表達成功能性蛋白）。在當時（1992年），人們還不知道在原表達基因已經被破壞了的情況下，是不會有RNA被轉譯出來的。檢驗的結果表明，變異的樣本中沒有αCaMKII或其殘缺版的mRNA，但是β-CaMKII的mRNA水平與正常小鼠的無異。

最後，西方檢驗是對蛋白質的檢驗。圖中最右一欄的是對照蛋白樣本。從圖中可以看到，變異純合子無αCaMKII，但有β-CaMKII。（註：beta-CaMKII有兩種亞型，因此圖中共有三個指示箭頭；kD為蛋白質質量單位。）

至此，我們可以下結論說，αCaMKII的基因變異模型被建立起來了。接下來要對其進行功能性檢驗。

2）解剖學及基本行為表現檢驗

如果對野生型和變異型小鼠的海馬區所在的前腦組織進行切片染色，你有什麼預期？兩者的海馬區會有差別嗎？有什麼樣的差別？

行為學上呢？外觀、體重會有差別嗎？基本的嗅聞行為（sniffing）、求偶行為（mating）和運動機能上會有差別嗎？

當然啦，你大可以做出兩者相差巨大的預期，畢竟發生了基因變異，其他基因的表達是否會受到影響誰也說不好。但是偏向著「成功模型」的預期是，兩者在解剖學和基本的行為表現上不應該存在顯著差異。不然要如何解釋後面學習差異的原因呢？

幸運的是，確實沒有多大的差別。變異小鼠（純合子）的新皮層和海馬皮層的細胞排列很正常，它們也會跑會跳會交配，沒有運動失調癥狀（ataxia）。有顯著性差別的地方僅在於兩處，其中一處是變異小鼠似乎更神經質一些，對於人類撫摸更加迴避。

另一處則是它們在用于衡量空間記憶能力的莫里斯水迷宮（Morris Maze）等實驗任務中表現出明顯的缺陷 。

3）突觸功能檢驗：全細胞記錄

為什麼要進行突觸功能的檢驗呢？之前說了嘛，就是因為以前的模型阻斷了NMDA受體，會影響到突觸功能，說不定對海馬迴路都產生了影響，所以無法說究竟什麼才影響了記憶（當然了，NMDA也影響記憶，但還不是核心機制）。

這樣一來，成功的預期也很明了了：變異的小鼠其突觸功能應當完好。

結果當然是如你所料啦（畢竟文章也發出來了_(:з」∠)_）：與野生小鼠相比，變異小鼠的突觸後電位形狀和峰值、阻斷NMDA或非NMDA受體通道後的突觸後電位峰值、電壓依賴性曲線都沒啥區別。也就是說，NMDA受體功能性在兩者身上無差。

有區別的地方也是對模型有利的。在野生小鼠的腦片中（in vitro），如果給予一次刺激後緊接著發放第二次刺激，那麼第二次刺激所誘發的突觸後興奮電位應當升高。這個現象稱Paired-pulse facilitaion（成對刺激促進作用）。變異小鼠的腦切片也體現出了這種促進作用，但是明顯不及野生型小鼠。也不奇怪，畢竟促進前膜突觸囊泡釋放的synapsin I分子，是由CaMKII調控的。

4）長時程增強作用（long-termpotentiation，LTP）受損

終於到了激動人心的時刻。

我們的預期也很簡單了，變異小鼠的LTP大概是受損嚴重，甚至根本就消失了。畢竟它們在海馬功能檢驗的一系列行為學測試中的表現令人失望（又令人滿意）。

首先進行的是場電位記錄（field potential recording），其記錄的是許多神經元的活動，衡量的是突觸強度（Synaptic strenghth）。突觸強度，指的是給予強直性刺激後，突觸後興奮電位隨時間的變化，用其與基線電位水平的百分比值表示。強直性刺激條件是100hz的20次刺激，每次刺激間隔11秒，共進行3個刺激串。結果如下圖。

?以給予刺激的時間點為時間軸零點。零點前記錄的為基線水平。給予刺激後，場電位峰值無明顯差異，但在接下來一個小時內的電位水平存在明顯差異：野生型小鼠出現了長時程增強作用，而變異小鼠則很快回到基線水平。這很好理解，因為CaMKII不參與短時程增強作用（與突觸前膜所釋放的神經遞質多少有關）。

接下來研究者對單個細胞進行了全細胞記錄（whole cell recording）。結果和場電位記錄是相似的。野生型小鼠在接受強直刺激後出現LTP，而變異小鼠則沒有LTP。有意思的是，有兩隻變異純合小鼠出現了LTP，但幅度明顯不如野生型。

?

結論：αCaMKII變異小鼠具有明顯的LTP缺陷。

二、αCaMKII蛋白上T286位點的自我磷酸化對LTP和學習記憶是否必要？（Giese et al., 1998）

時間已經行進到1998年了。對，就是《相約九八》的那個九八年。小時候聽歌，總以為是《相約酒吧》，想不明白為什麼1998年就要去酒吧，感覺很不「正經」。

言歸正傳。

還記得我們一直說的嗎，αCaMKII蛋白一旦自我磷酸化之後就不再依賴於Ca++或者CaM的水平。那麼自我磷酸化是否是必要的呢？這篇文章要驗證的就是這一點。雖然一作換了人，但是通訊作者還是Silva。文章還是發在Science上。

研究模型的建立：

將286位點上的蘇氨酸（T286）替換為丙氨酸（T286A），這樣一來，該位點就不能轉換到不依賴於CaM水平的狀態了。也就是說它無法自我磷酸化了。接下來用Cre-LoxP系統進行DNA重組置換，將修改後的序列用質粒載體插入原基因序列中，再用新黴素進行篩選，最後用Cre重組酶剪掉LoxP位點及neo基因，得到目標基因序列。

上述模型通過了PCR和Western blot檢測，解剖形態學分析也表明，野生型小鼠與變異小鼠的海馬區腦組織切片無異。

場電位記錄結果，與野生型相比，失去自我磷酸化能力的T286A小鼠沒有LTP，但其突觸傳遞能力沒有受損。

單個神經元的全細胞記錄也出現了相似的結果。

行為學測驗用的仍然是莫里斯水迷宮。圖中的空心圓圈表示的是野生型的測試結果，而實心方塊表示的是變異小鼠的測試結果。可以看到，經過10次左右的測試後，野生小鼠很快就能找到水中的隱藏平台，而變異小鼠需要花費更多的時間（A），並且一旦撤掉可見平台上的旗子，野生小鼠就很難找到平台（D-E）。

結論：αCaMKII蛋白上T286位點的自我磷酸化對LTP和學習記憶來說是必要的。

三、加強αCaMKII的自我磷酸化能夠使小鼠變聰明嗎？（Mayford et al., 1996）

仍然是Science上的文章。該文發表於1996年。一作又換了人，但是仔細一看，通訊作者是諾獎得主Eric R. Kandel，那本神經科學聖經Principles of Neural Science的編者之一。

在這項研究中，他們採用了與前兩篇文章不一樣的基因編輯手段，轉基因技術。

相比於基因打靶技術，轉基因技術不要求進行基因序列定位，只要把載體打進去就好了。這樣一來，又省錢省力，但缺點就在於，你不知道轉基因究竟轉入了原始基因序列中的什麼位置。它有可能會干擾正常的基因表達，也可能不會。因此，如果要使用轉基因技術進行研究，需要用多個不同的品系，得到一致性結果才能驗證你想要驗證的結論。

研究者使用了強力黴素（Doxycycline）來調控轉基因的表達。如圖，他們生產了兩種類型小鼠。第一種類型的小鼠能在αCaMKII啟動子的調控下表達tTA，而另一個類型的小鼠會在tet-O啟動子的調控下表達CaMKII-Asp286。 Asp286是286位點的另一種變異，與上文中無法自我磷酸化的T286A相反，它能使CaMKII上的酶一直處於不依賴於Ca++的狀態，也就是一直都在自我磷酸化。

而這兩種轉基因小鼠交配產生的子代小鼠，部分會同時帶有兩種基因。這會產生什麼樣的效果呢？當tTA結合在tet-O啟動子上的時候，CaMKII-Asp286就能夠表達，但如果給予強力黴素（Doxycycline，DOX），那麼DOX就會與tTA結合，並脫離tet-O啟動子，從而關閉CaMKII-Asp286的表達。

這麼做是要幹嘛？上一篇文章不是說阻斷自我磷酸化小鼠就變笨了不會學習了么。好嘛，那我就讓它一直一直磷酸化，是不是就會變聰明啦？這idea真的很棒棒哦。讓我們來看看場電位記錄和行為學測試的結果。

超乎想像的是，一直自我磷酸化並不會產生更強的LTP，反而失去了LTP。並且在空間記憶實驗的Barnes水迷宮中，實驗老鼠也表現得很差勁（B13和B22表示的是用於轉基因的不同品系）。也就是說，過度的自我磷酸化並不能讓小鼠變

結論：過度的自我磷酸化並不能增強記憶能力。

四、對記憶力增強的不懈追求 （Tang et al., 1999）

1998~1999年，Nature發了兩篇文章，都是關於記憶力增強的實驗。1998年的那篇文章（Migaud et al., 1998）表明，通過PSD-95來增強LTP並不能提升記憶力表現。99年的這篇文章則表明，NMDA受體亞型NR2B的國度表達，有利於提高NMDA受體的活性，並促進了突觸增強作用。

他們的做法並不複雜，使用的也是轉基因技術，讓NR2B過表達。

?

NR2B受體通道的開放時間要長一些。

場電位記錄表明，NR2B過表達的變異小鼠不僅擁有增強的LTP，而且也保留了LTD。

也許正是因此，它們在行為學的測試中才表現得更聰明，恐懼條件發射建立和消退得都更快。

結論：NR2B受體在前腦的過表達能夠提高NMDA受體活性，提高突觸促進作用，並使個體在學習和級以上的表現更好。

五、結語

時至今日，學習與記憶的研究仍然屬於熱點問題。我國的腦科學研究重點就在於學習、記憶與教育。為什麼學習與記憶這麼重要？站在普通年輕人的角度上看，提高記憶力好像無非就是記東西更好一些罷了，貌似也沒有什麼很大的提升。而且說實話，又能提升多少呢。但是對於某些人群來說，比如智力障礙（intellectual disorder）患者或是老年人，這一點點改變所帶來的影響是巨大的，對生活質量的提升也是很明顯的。

另外，在接下來的專欄文章中，我們也會提到，記憶與情緒的關聯作用。從某種意義上來說，很多情況下，記憶無意識地影響了我們的知覺、情緒、思維、執行能力等各個方面。它好像是你最不可或缺的工具書，最常用的代碼模塊，最長陪伴於身邊的物件，比如一副耳機，一塊手錶，一支鋼筆，而你每天都在無數次地使用它。它與你緊密關聯，說它就是你的影子也不為過。

參考文獻：

Silva, A. J., Paylor, R., Wehner, J. M., & Tonegawa, S. (2009). Impaired Spatial Learning in L-Calcium-Calmodulin Kinase Mutant Mice, 257, 6.

Silva, A. J., Stevens, C. F., Tonegawa, S., & Wang, Y. (2009). Deficient Hippocampal Long-Term Potentiation in o-Ca cium- Calmodulin Kinase Mutant Mice, 257, 6.

Giese, K. P. (1998). Autophosphorylation at Thr286 of the  Calcium-Calmodulin Kinase II in LTP and Learning. Science, 279(5352), 870–873. https://doi.org/10.1126/science.279.5352.870

Migaud, M., Charlesworth, P., Dempster, M., Webster, L. C., Watabe, A. M., Makhinson, M., … Grant, S. G. N. (1998). Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature, 396(6710), 433–439. https://doi.org/10.1038/24790

Tang, Y.-P., Shimizu, E., Dube, G. R., Rampon, C., Kerchner, G. A., Zhuo, M., … Tsien, J. Z. (1999). Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature, 401(6748), 63–69. https://doi.org/10.1038/43432

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