急！提純你的DNA樣本？？？

在分子生物學實驗中，提純DNA樣本是十分常見的步驟。純凈無雜質的DNA有助於下一步或幾步實驗的發生和成功。有時候DNA是直接從細胞提取出來的、有的時候要用到從PCR反應中來的DNA、或是在酶切反應後來的DNA；那麼就有可能攜帶細胞裂解時的碎片、殘留的蛋白質、或是殘留的鹽溶液。這些物質有可能影響到下一步的反應，所以需要被清除掉以獲得純凈的DNA。小編在這裡介紹四種提純DNA的方法供大家討論。

苯酚-氯仿抽提法

苯酚和氯仿是常見的有機溶劑，一般可以用來將蛋白雜質從DNA樣本里去除。基本原理是，有機溶劑會使雜質蛋白變性，並將雜質蛋白留在有機溶劑層，而DNA分子是有水溶性的，所以會進入水溶液層【1】。這樣DNA和雜質蛋白就被分開了。這個方法的好處是便宜有效，特別是在提取基因組DNA時，要去掉許多從細胞裂解液中帶來的蛋白，苯酚法十分好用但苯酚和氯仿是有毒溶劑，而且有可能會殘留在提純過後的DNA樣本中，對後續反應造成影響。

苯酚抽提的基本步驟

將同體積的苯酚和（DNA+蛋白）混合物溶液混合；

苯酚和水溶液不互溶，所以分層，水層在上，苯酚層在下。快速震蕩，讓兩層充分混合；

靜置讓兩液層分開，分離水層，在水層中得到的應該是大量的DNA和可能少量的蛋白質。

苯酚抽提基本原理

最核心的原理是水和苯酚作為有極性差異的溶劑，對DNA和蛋白質有不同的溶解能力。因為水分子中的氧原子有更強的電負性，共用電子對向氧原子偏離，產生了看似略帶負電的氧原子端和略帶正電的氫原子端，所以我們說水是很有極性的溶劑（如下圖）。苯酚也有極性，但不像水分子那麼明顯，因為苯環也有電負性，所以苯酚的氧原子並不能太強吸引周圍的電子（如下圖）。

有一點我們是清楚的，DNA可溶於水，原因就是DNA也是有極性的分子（如下圖，DNA分子的糖–磷骨架上的磷酸基團是帶負電的）。對於一物質是否水溶，我們基本可以總結出：有極性（polar）=親水性（hydrophilic）=可溶；無極性（non-polar）=憎水性（hydrophobic）=不溶。

還有一點我們也是清楚的，細胞液環境是水環境，裡面到溶解著各種蛋白質。蛋白質作為長鏈氨基酸，在形成有效結構的時候，外表面多是有極性的親水類氨基酸（如谷氨酸、Glu；賴氨酸、Lys和組氨酸、His），內核多是沒那麼有極性的憎水類氨基酸，所以能夠穩定的存在於水溶液中。

但是，在苯酚抽提法中，蛋白質在水中的溶解度被改變了。水溶液作為極性溶劑，導致了蛋白質的極性氨基酸在外，而沒那沒有極性的氨基酸在內；苯酚的到來，使得這些沒那麼有極性的氨基酸有了出頭之日，他們被翻了出來，而那些有極性的氨基酸則被塞進蛋白質內核，以適應苯酚溶劑（基本原理如下圖所示）。這樣一來，變性的蛋白進入苯酚層，DNA則停留在水層。這也是為什麼，有機溶劑會讓蛋白質變性，因為不可逆地破壞了蛋白的整體結構。

苯酚抽提的過程和蛋白質變性原理

乙醇沉降法

乙醇沉降法其實就是一種鹽析方法。鹽陽離子（一般是Na+、醋酸鈉鹽）和70%的乙醇加入到DNA樣本中後，陽離子與帶負電的DNA骨架相互作用，從水分子那裡將DNA搶奪出來，而乙醇改變了DNA的結構，使得DNA聚合最終沉降【2】。這個方法的好處也是便宜有效，但十分費時，而且乙醇也有可能被帶入下一步反應中。

乙醇沉降法基本步驟

將鹽溶液和乙醇與DNA溶液混合後，DNA會被析出形成固體，經過一定時間的離心沉澱，DNA就可以從混合溶液中分離出來。最後使用冷的70%乙醇沖洗DNA沉澱，最終獲得純凈的DNA沉澱。DNA沉澱在靜置晾乾後可以直接溶於水溶液（如下圖）。

乙醇沉降法基本原理

首先，我們要了解的是DNA分子為什麼可以溶於水。作為極性分子，水分子可以被看成氧原子帶部分負電，氫原子帶部分正電，因此可以很好的穩定住帶負電的磷酸基團。

那麼，當我們向DNA水溶液中加入鹽溶液（一般常用乙酸鈉）時，帶正電的 Na+ 會和水分子競爭去接觸負電磷酸基團的機會，一旦Na+ 搶奪到了DNA分子的磷酸基團，DNA分子就不那麼受水分子喜歡，所以就變得有憎水性，可以從水分子中析出。

既然 Na+ 和DNA分子接觸後可以看成是有了憎水性，而我們想讓這個憎水性更強，乙醇就在這時發揮作用。 Na+ 和PO3- 兩基團是在動態碰撞中相互接觸，並不會像共價鍵似得結合在一起，所以Na+ 和PO3- 之間的接觸機會是由阻擋在他們之間的溶劑決定的，電容率高的水分子比電容率低的乙醇分子更容易也更喜歡阻擋Na+ 去尋找PO3- 。所以試想一下，如果我們是Na+ 和PO3-，肯定更喜歡待在乙醇環境中。因此環境改變，使得DNA分子的憎水性更強。

最後一步就是使用冷乙醇沖洗掉任何殘留的鹽，保證DNA的純凈度。當然，在了解過大致原理以後，我們還是有很多事項要注意，比如鹽的使用、乙醇好還是異丙醇好、用多大量的乙醇等。

硅膠柱吸附法

最常見的就是市面上各種PCR purification kit、mini-prep kit和gel extraction kit。只有被離液鹽擾亂了氫鍵的DNA分子可以被吸附在硅膠模上，最後可以被低鹽溶液析出。這個方法的優勢就是快速高效，可以一次處理大量不同的DNA樣本。不足之處就是成本略高。

基本原理如下圖所示。在高鹽環境中，鹽陽離子打破硅膠負氧根和水之間的氫鍵，使得整體的硅膠攜帶正電，正好吸引攜帶負電的DNA分子。當DNA分子附著在硅膠上時，洗滌液可以將不能與硅膠結合的雜物分子洗掉。然後，使用低離子強度的緩衝液或者水，可以將DNA洗脫出去。加熱過的洗脫液（<50°C）可以加速DNA從硅膠膜上脫離下來。不同的硅膠由於製作方法不同，會擁有不同的膜孔大小，所以可以攔截吸附不同長度的DNA分子。

磁珠吸附法

這個方法的主要原理是，在攜帶正電的磁珠和DNA分子特定結合後，磁珠被固定在磁極上，DNA樣本中的其他雜質在此時被移除，而後使用高pH的洗出液使得磁珠帶負電，因此DNA分子又會脫離磁珠，被洗出。Thermo Fisher公司出的ChargeSwitch 就是用磁珠吸附法來提純DNA的。

Reference:

【1】Kirby, K. S. (1957). A new method for the isolation of deoxyribonucleic acids: evidence on the nature of bonds between deoxyribonucleic acid and protein. Biochemical Journal, 66(3), 495.

【2】Eickbush, T. H., & Moudrianakis, E. N. (1978). The compaction of DNA helices into either continuous supercoils or folded-fiber rods and toroids.Cell, 13(2), 295-306.