CellMax 細胞大課堂1-1｜細胞計數知多少？

05-21

來自專欄細胞培養俱樂部

上期，給大家簡單介紹了細胞學相關技術，從這期開始，我們將分別為大家詳細介紹各種細胞學相關的實驗技術。

秉持「少即是得」的原則，我們預定每一期只詳細介紹一種技術，最終都彙集在CellMax細胞大課堂，為大家儘可能地提供方便。大家也可以在下方留言版塊寫下最希望了解的技術或者貢獻您的寶貴意見，我們將為大家精心準備您想知道的一切~

這一期，我們將為大家介紹的是手工細胞計數法。因為在細胞培養技術中，細胞計數應是一項基本功，對於標準化培養條件以及需要精確定量的實驗來說都非常關鍵。

下面即是手工細胞計數的基本流程、原理和意義：

1.計數前首先準備好細胞計數器（血球計數板）：

使用70%乙醇將蓋玻片和細胞計數板清潔、晾乾備用。

將晾乾的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數器上。

（注：使用前須保證蓋玻片和計數板已充分晾乾，否則將影響後續細胞充池及計數結果。）

2.製備細胞懸液：

對於貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養皿表面脫落。（懸浮細胞則無需消化，稀釋到合適倍數即可。）

然後加入適當的含血清培養基，中和胰酶的作用並重懸細胞，以得到均質的細胞懸液。要求儘可能將細胞吹散，不要殘留任何細胞團，但不可用力過大。

（注：消化太過或消化不全均會使計數結果產生偏差。）

台盼蘭染色（可選）：

如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%台盼蘭等體積混合；

室溫孵育3-5分鐘（懸浮細胞染色時間可視情況適當延長），使台盼蘭完全進入死細胞，使死細胞著藍色。

3.充池：即血細胞計數器加樣

使用吸管或移液器將細胞懸液或細胞/台盼蘭混合液滴加到計數池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池，此即為充池。

（註：若需進行多個樣品的計數，應盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。）

以同樣的方式在另一側的計數池中也加入計數樣品。

將計數板靜置幾分鐘使細胞擴散、沉降。

4. 細胞計數：

在100倍顯微鏡下，移動計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網格。中央方塊區差不多剛好可以填滿整個視野（圖1中標記的3號位置）。

圖1.細胞計數板圖解

分別計數大方格1.2.4.5中的細胞數。（為降低計數誤差，最好將細胞濃度調整為20-50個/大方格。）並重複記錄另一側計數池中的細胞數，總計8個大方塊，然後取均值。

計數原則為：「數上不數下，數左不數右」。（判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線，如圖2所示）。

圖2. 細胞計數原則

如果有多個細胞沒有吹散而成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數細胞為單個細胞。

5. 細胞濃度計算：

圖3. 樣品充池體積圖解

由圖3可以得出，每個大方格的容積為：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml

即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數時需乘以104。

在常規沒有使用台盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數：

每毫升樣品中細胞的個數 = 每個大方格內細胞的平均數 × 細胞稀釋倍數×104

如果使用了台盼蘭染色，還需要計算活細胞的百分率：

活細胞百分率（%）= 台盼蘭拒染細胞數/總細胞數×100

此時活細胞數的計算公式為：

每毫升樣品中活細胞的個數 = 每個大方格中細胞的平均數×活細胞比率×細胞稀釋倍數×2×104

註：乘2是由於在台盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當於稀釋了一倍。

看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們為什麼要數細胞啊？細胞計數究竟有什麼意義呢？其實，當我們想了解細胞的生長情況時，除了直接觀察細胞形態以外，繪製細胞生長曲線、計算細胞倍增時間應該就是廣泛採用的評價指標了。

所以儘管使用血細胞計數板手工計數細胞過程十分繁瑣，對實驗者操作者的要求也比較嚴格，現在也已有很多自動化的細胞計數器/儀，但對於科學研究中遇到的各種細胞而言，手工計數仍然是最簡便易行的方法而被廣大實驗室採用。

好了，關於手工細胞計數方法就介紹到此，祝大家實驗順利~

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