實驗室●基礎篇 你應該知道的質粒那些事兒

實驗室●基礎篇 你應該知道的質粒那些事兒

一定要做一個高尚的質粒，一個純粹的質粒，一個有道德的質粒，一個脫離了低級趣味的質粒，一個有益於人民的質粒。

小白是一個實驗新手，很多時候提質粒提出來的濃度都有很大差異，有的高達500~600ng/uL，有的卻只有幾十。用的都是相同的菌株和試劑盒，為什麼小提濃度會有這麼大的差別呢？

要解決小白問題，我們得先來了解下質粒。

拷貝數

對於質粒載體，拷貝數是我們最關心的特性之一。實際上，每個細菌中的質粒的拷貝數主要決定於質粒本身的複製特性。按照複製性質，可以把質粒分為兩類：

嚴緊型質粒：當細菌染色體複製一次時，質粒也複製一次，每個細菌內只含1～2個質粒；

鬆弛型質粒：當細菌染色體複製停止後仍然能繼續複製，每一個細菌內一般含20個左右質粒拷貝。這些質粒的複製是在寄主的鬆弛控制之下的，每個細菌中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還可使質粒拷貝數增至幾千份。

當然，恆定的拷貝數與質粒複製控制系統、質粒的大小及培養條件有關。

那麼到這裡你可能會問，高拷貝質粒我們可以多提一點質粒，低拷貝數的質粒有什麼作用呢？確實，低拷貝數的質粒用途不是十分廣闊，主要用於以下兩點：

1. 高拷貝數的質粒往往不穩定，進行大片段克隆或者帶有毒性DNA克隆時會用低拷貝；
2. 質粒的擴增會佔用大量資源，當載體用於表達或者其他用途時，也會使用上低拷貝質粒。

質粒的接合轉移與穿梭質粒

質粒的接合轉移：是細菌遺傳物質轉移的一個重要方式。在質粒轉移過程中，供體菌和受體菌通過結合作用緊密接觸，質粒從供體細胞向受體轉移，同時進行質粒複製。按能否自主轉移，可以將天然存在的質粒分為轉移型質粒和非轉移型質粒兩大類。

這裡要注意的是，獲得質粒的細菌可隨之而獲得一些生物學特性，如耐藥性或產生細菌素的能力等。從環境友好出發，實驗室里的廢棄菌液，一定要滅過菌才能倒哦！

穿梭質粒：是指一類人工構建的具有兩種不同複製起點和篩選，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和複製的質粒載體。此概念不僅用於不同的微生物菌群之間，也可以推廣到真核生物表達載體的構建，如用於枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳動物表達載體pMT2 和用於植物細胞的Ti 質粒。這些穿梭質粒不僅可以在大腸桿菌中複製擴增，也可以在相應的枯草、酵母、動物或植物細胞中擴增和表達。這樣利於對質粒的分子生物學操作和大量製備。

質粒的不相容性

通俗來說，就是一山不能容二虎。但是作為科學來說，我們需要一個嚴謹的定義。

「利用同一複製系統的兩個質粒會在複製和隨後向自細胞的分配過程中彼此競爭，這樣的質粒在細菌培養物中不能和平共處，這種現象稱之為不相容性」。

那要怎麼才能在一個菌裡面使用兩個質粒呢？簡單的方法就是使用不同複製源的且帶有不同抗性基因的兩個質粒。

如何讀懂一個質粒

如何讀懂一個質粒，我們以一個例子說明：

1. 首先看複製起點Ori： 了解質粒是原核質粒/真核質粒/穿梭質粒。
2. 看篩選標記：一般是抗某種抗生素基因，便於後期篩選，比如上圖中抗性為Amp抗性。
3. 看多克隆酶切位點MCS：我們目的片段就是要插入這些多克隆酶切位點中間。
4. 看是否含有表達系統原件即啟動子-核糖體結合位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。

質粒圖譜哪裡去找？

方法一：使用 Vector NTI 軟體

Invitrogen 公司的這款軟體絕對是分子生物學蟲子們的福音。這款軟體的軟體包裡面會包括 Invitrogen 公司的所有質粒圖譜信息和其他比較常見和經典的質粒圖譜。要想對質粒圖譜了解更直觀，安裝這款軟體是非常必要的。

另外再給小夥伴們介紹兩款基因序列分析編輯的軟體：SnapGene和DnaStar，在我們的菜單「科研管家」里有介紹哦。

方法二：查找質粒圖譜的網站

Addgene

地址：http://www.addgene.org/

Vector DB

網址：http://genome-www.stanford.edu ... .html

此網站頁面比較簡陋，但分類比較直觀，總結和分類都比較完整。基本包括了所有表達系統的質粒信息。

NCBI

網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

這個名氣太大就不介紹了。

Google 及 Google 學術

Google 確實是個好東西，學生物的應該好好的學習下它的用法。

檢索式子：質粒名 + map

質粒名 +sequence +filetype:txt or filetype:pdf

或者：進入 google，點擊「圖片搜索」，直接查找圖譜。

其他的一些核酸資料庫

歐洲分子生物學實驗 EMBL：http://www.ebi.ac.uk/

方法三：如何查找經過改造過的質粒的質粒圖譜

有些質粒是經過改造的，所以通過上述方法不能查詢到相應信息。這時，可以在 google scholar 中輸入質粒名稱，可以直觀地看哪些學者在何文章中使用了該質粒，從而可了解到質粒的來源或者籍此向作者諮詢或索取。

小白的質粒可能是一個低拷貝質粒，一個嚴謹的質粒，一個溫度敏感的質粒

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