CRISPR-Cas9應用——基因敲除與敲入系統

文章簡介

對於我們研究人員來說，比較關心的是，目前CRISPR/Cas9基因編輯技術有哪些成功的技術應用？這些技術又如何應用到實驗中？本篇文章主要從實驗原理、實驗流程步驟，兩方面來介紹CRISPR-Cas9基因敲除系統（knockout）和CRISPR-Cas9基因敲入系統（knock in）

CRISPR-Cas9基因敲除系統

實驗流程：

1設計sgRNA

2構建sgRNA-Cas9載體

3構建sgRNA-Cas9穩轉株

4 篩細胞克隆並進行qPCR驗證

5 陽性克隆測序，選擇敲除純合細胞株

6 篩選細胞單克隆測序

實驗步驟：

1、設計sgRNA

針對小鼠LIF基因座（Musmusculus，NM_008501）設計了三種sgRNA。進行軟體分析以確保sgRNA沒有預測的脫靶結合位點。

2、構建sgRNA-Cas9載體

然後將選擇的sgRNA設計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-Onelentivector中（圖1）

3、構建sgRNA-Cas9穩轉株

利用慢病毒包裝體系構建sgRNA-Cas9穩轉株，進行嘌呤篩選

4、 篩細胞克隆並進行qPCR驗證

嘌呤黴素篩選後分離細胞克隆。提取基因組DNA並進行驗證測定目的基因座是否進行編輯

在野生型（WT）測定中的單個條帶表示沒有發生編輯; 兩個較小的條帶（總和WT的長度）表示編輯已經發生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒有編輯; 克隆1是不確定的。

5、 陽性克隆測序，選擇突變細胞株

通過Sanger測序進一步分析細胞集落3和6的PCR產物以確定敲除的性質（圖3）。

對於細胞集落3，只檢測到一個突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。

6、 篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株

將菌落6連續稀釋到96孔板中進行單克隆選擇。從這些克隆（即6a，6b ..）中提取基因組DNA，進行PCR擴增，克隆和測序。

測序顯示，在兩個等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。移碼突變破壞了開放閱讀框架，導致無意義介導的mRNA。

7、進一步測序，確定純合突變

CRISPR-Cas9基因敲入系統（knock in）

實驗原理：

CRISPR-Cas9基因敲入系統是Cas9內切酶切割雙鏈DNA，且有一段高度同源的DNA修復模板存在的情況下，生物體內啟動HDR修復路徑，將一段外源DNA定點插入基因內部。

同源性定向修復（HDR）途徑，對比NHEJ修復途徑，同源性定向修復（HDR）途徑是更為精確的修復機制。這種修復機制主要用於CRISPR Cas9系統介導的基因敲入。在該修復路徑中，需要將一段與預期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中。

在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點（圖4）。這種修復方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點。

實驗流程

1 設計sgRNA-Cas9及修復DNA模版

2 構建sgRNA-Cas9質粒及修復DNA模板質粒

3 將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉293T細胞

4 嘌呤篩選，檢測熒光

5 PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入

實驗步驟

1 設計sgRNA及修復DNA模版

針對人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設計了sgRNA進行軟體分析以確保sgRNA沒有預測的脫靶結合位點。設計DNA修復模版，兩側同源臂，其兩側各有600bp的同源臂。

2 構建sgRNA質粒及修復DNA模板質粒

將選定的sgRNA設計與CMV啟動子驅動的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以製備pCas-Guide-AAVS1。

將DNA修復模板插入含有RFP-嘌呤黴素的pAAVS1-RFP-DNR表達載體。

3 將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉293T細胞

用lipofectmine2000轉染試劑將上述兩種質粒轉染至293T細胞。

4 嘌呤篩選，檢測熒光

嘌呤篩選3-4周

3-4周後，> 95％的HEK293細胞表達RFP（圖3）。

A轉染篩選後明場圖片 B轉染篩選後熒光圖片 C未轉染加嘌呤篩選細胞

5 PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入

為了證實在基因組DNA中敲入RFP，設計引物對，引物1靶向RFP上游的5同源臂和靶向RFP-嘌呤黴素基因內的引物2。

1.1kb的PCR產物表明在AAVS1位點敲入成功; 沒有PCR擴增指示敲入不成功（圖4）。

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