零基礎的人如何學會使用CRISPR/Cas9技術

作為基因組靶向改造（敲除和敲入）的遺傳學手段，基因組編輯技術歷經ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，已發展成為自20世紀70年代生物技術時代開啟以來最重要的基因工程技術。因沒有物種限制、簡單、高效，以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術已廣泛應用於人、大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、豬、羊、水稻、小麥和擬南芥等動植物（細胞）以及細菌等微生物的基因組靶向改造，成為後基因組時代的功能基因組研究、動植物品種改良、疾病模型建立以及基因治療等不同領域研究與應用的利器。

南京大學趙慶順教授為各位學員系統講解基因組編輯知識，通過三天現場的 「講座 + 實驗 + 答疑」的學習和交流，有機會全面掌握CRISPR/Cas9技術應用的方法及技巧。

日程安排

第一天上午9:00-12:00

第一講、基因組靶向修飾技術簡介

1、基因功能研究的分子遺傳學技術簡介 2、基於NHEJ修復的基因敲除和基於HR修復的基因敲入

3、ZFN和TALEN技術 4、CRISPR/Cas9技術

第二講、CRISPR的設計

1、目標基因結構及功能的生物信息學分析 2、CRISPR的設計原則 3、CRISPR的在線設計（可自帶可無線上網之筆記本電腦或手機） 4、靶向編輯基因的基因型確認及CRISPR的再設計

第一天下午13:00-17:00

第三講、基因組編輯工具的製備及向細胞內的遞送策略

1、基因組編輯工具之DNA表達元件的製備與遞送策略 2、基因組編輯工具轉錄產物製備及遞送策略 3、基因編輯工具RNP的製備與遞送策略

實驗（或技術細節答疑）一： CRISPR/Cas9 基因組編輯工具All-in-One表達質粒的構建（1）

1、CRISPR模板引物的準備 2、CRISPR模板的製備 3、退火CRISPR模板與線性化CRISPR/Cas9 All-in-One載體的重組 4、大腸桿菌的轉化 5、攜帶基因組編輯工具的轉化子的塗板培養

第二天上午9:00-12:00

第四講、sgRNA活性驗證

1、體外法 2、體內法 2.1 插入缺失（Indel）突變檢測的基本策略 2.2 基於胚胎反應器的活性驗證方法 2.3 基於細胞系的活性驗證方法

實驗（或技術細節答疑）二：CRISPR/Cas9 基因組編輯工具All-in-One表達質粒的構建（2）

基因組編輯工具之CRISPR/Cas9 All-in-One重組子的快速驗證法（PCR法）

實驗（或技術細節答疑）三：基因組編輯子等位基因的基因型鑒定

1、基因組DNA模板製備 2、目標基因的基因組DNA片段的PCR擴增

第二天下午13:00-17:00

第五講、利用CRISPR技術創建基因組編輯人及動物細胞系

1、創建基因組編輯細胞系的基本過程 2、基因敲入的供體DNA的設計原則及基因敲入供體設計實例

3、表達CRISPR的All-in-One表達質粒（和供體）導入細胞系的方法 4、陽性細胞克隆篩選 5、靶向突變的基因型鑒定及基因組編輯細胞系的建立 6、敲入基因和敲除基因（無效等位基因）的確認 7、建立基因組編輯細胞系的優選策略

第六講、利用CRISPR技術創建基因敲除或敲入動物

1、創建基因組編輯動物突變體的基本過程 2、sgRNA/Cas9 mRNA（和供體）共顯微注射入受精卵中建立初建者 3、初建者體細胞攜帶靶向突變等位基因的確認 4、基因敲除/敲入動物（F1）的鑒定 5、基因敲除/敲入動物品系（F2）的建立 6、敲除/敲入基因的確認 7、建立基因敲除或敲入突變體動物的優選策略

第七講、利用CRISPR技術創建基因敲除或敲入植物

1、創建基因組編輯植物突變體的基本過程 2、雙元載體的轉染 3、基因敲除/敲入植物（F1）鑒定

實驗（或技術細節答疑）四：實驗結果的點評與討論

1、CRISPR/Cas9 All-in-One重組子的PCR產物電泳檢測結果點評 2、基因組編輯等位基因的基因型鑒定電泳檢測結果的點評 3、測序是驗證基因組編輯結果的金標準

第三天上午9:00-12:00（12:00以後課程結束）

第八講、基因組編輯技術的脫靶問題

1、脫靶的產生原因 2、脫靶檢測 3、解決脫靶問題的方法 4、脫靶問題對不同領域研究者的意義

第九講、利用CRISPRi或CRISPRa技術調控基因在細胞中的表達

1、dCas9的特徵簡介 2、運用CRISPR技術調控基因在細胞中表達的基本實驗過程 3、CRISPR技術的轉錄抑制 4、CRISPR技術的轉錄活化

第十講、CRISPR技術的倫理學問題

1、 新型基因組編輯技術的發展（鹼基編輯） 2、基因組編輯技術的應用 3、基因組編輯技術對未來社會的革命性的影響 4、基因組編輯技術的倫理學問題

【時間地點】 2017年5月12-14日 南京市 江北新區 浦口經濟開發區低碳谷

【收費標準】

3300元/人 (不含住宿費)。

聯繫人：張老師 15021527076 郵箱：meta2014@126.com

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