【工具】Gateway設計ishRNA（二）

來自專欄 生物超循環

上一章我們討論了ishRNA合成的整個流程。

那麼我們如何開始呢？

這一章我們從設計Oligo開始。

在設計Oligo之前，你需要已經知道shRNA target哪個序列是最有效的。

比如說我之前已經在某個公司訂了好多shRNA，經過測試，發現其中的兩個的敲低效率最高。

那麼我就選這兩個shRNA，來進一步合成ishRNA。

一般從公司訂的shRNA都會告訴你它的序列，你只需要把序列拆解成 antisense-loop-sense就可以了。如果你是從sigma訂的話，序列拆解過程可以看我的 」【工具】shRNA的設計「 。

Oligo設計的本質其實就是完成下圖黑色（不是灰色）的部分：

Top Oligo以CACC開頭，Bottom Oligo以AAAA結尾。

接下來開始設計中間的部分。

要記住，shRNA的開頭應該由A或者G開頭，因為C和T不穩定。

如果你想要以A開頭，那麼：

• 如果shRNA前面的序列自帶A，那麼後面就把A對應的T刪掉， 如圖，以CGA結尾，沒有三個T。
• 如果shRNA前面的序列沒有A，那麼你在前面加一個A，後面仍不需要加對應的T。

一句話概括，就是沒A就加A（後面不動），有A就刪T（動後面）。

假設你想要以G開頭，那麼：

• 如果shRNA前面自帶G，那麼後面額外加一個C。
• 如果前面沒有G，那就加一個G，後面不要額外加C，如圖，以CAG結尾，沒有C.

一句話概括，沒G就加G（後面不動），有G後面額外加C（後面動）。

所以，當你shRNA開頭為T或者C的時候，改動其實是最簡單的，只需要在前頭加個A或者G就行了；但是如果你是A或者G開頭的話，那你前頭不用動，後面就得稍微改一改了。

至於中間的loop部分，你有如下三種選擇：

• 5-CGAA-3
• 5-AACG-3
• 5-GAGA-3

製作好了Oligo，接下來把它們連在一塊兒，形成雙鏈DNA，把其ligate進入pENTR，導入e.coli，提colony，測序。

Oligo的設計只要遵循上面的法則就不難，是不是很簡單呢？