研究方案還沒定？「腸道菌群與疾病的分析思路」給你靈感

近年來，腸道菌群的研究異常火爆，特別是關注疾病研究的朋友們，每周都會在Science、Nature、Cell或者別的頂級學術期刊上發現幾篇腸道菌群與疾病相關的文獻，時刻刷新著我們對腸道菌群的認知，腸道菌群的作用真可謂是只有我們想不到，沒有它們做不到的。

那麼，該如何進行深度分析挖掘，才能比較徹底地了解腸道菌群與疾病的「愛恨情仇」。小銳最近看相關的文獻比較多，在此給大家分享一下腸道菌群與疾病相關的分析思路。

1. 疾病患者腸道菌群的特徵

比對物種資料庫，得到物種丰度表，簡單描述門、綱、目、科、屬、種各個水平上物種丰度組成，一般描述優勢物種的組成情況。當然也可以通過CAG、MGS等演算法，獲取菌株水平上的丰度信息。

圖1. 哈扎狩獵者和印度人門水平上優勢物種分布[1]

2. 研究菌群是否是引發疾病的因素

一般使用小鼠模型進行菌群移植，分為同籠飼養和無菌小鼠灌胃、灌腸等移植方式。

2.1 同籠飼養

同籠飼養小鼠時，小鼠的食糞習性可以實現腸道菌群的移植。Buffington等為了證明自閉症與腸道菌群有關，首先用小鼠模型研究了高脂飼餵的孕期小鼠後代容易表現出自閉症的癥狀，並且其腸道菌群的組成與正常飲食飼餵的孕期小鼠後代不同。繼而對高脂飼餵、正常飲食飼餵的孕期小鼠後代使用同籠飼養的方式，實現不同飲食模式小鼠的菌群移植，結果發現同籠飼養的高脂孕期小鼠後代的腸道菌群發生了變化，菌群組成與正常飲食孕期小鼠後代的更相近（圖2）[2]。

圖2. 同籠飼養小鼠腸道菌群組成的PCA分

紫色代表正常飲食孕期小鼠後代；藍色代表同籠飼養的正常飲食孕期小鼠後代；紅色代表高脂飲食孕期小鼠後代；黃色代表同籠飼養的高脂飲食孕期小鼠後代。

2.2 無菌小鼠移植

無菌小鼠灌胃、灌腸等菌群移植的方式是最常採用的菌群移植方法。Buffington等研究無菌小鼠和正常小鼠時，發現無菌小鼠出現自閉症的行為特徵，因此猜想菌群是否是影響自閉症的原因呢。接著將正常飲食孕期小鼠的後代和高脂飲食孕期小鼠的後代的腸道菌群移植到無菌小鼠內，發現移植高脂飲食孕期小鼠後代腸道菌群的無菌小鼠行為不正常，菌群組成與移植正常飲食孕期小鼠後代的無菌小鼠的組成不同。

圖3. 第四周和第八周移植正常飲食孕期小鼠後代腸道菌群（藍色）和移植高脂飲食孕期小鼠後代腸道菌群（紅色）的無菌小鼠腸道菌群組成的PCA分析

聯用兩種方法來研究菌群是否為引發疾病的因素，無疑給這篇文獻增加了亮點。

3. 找到疾病相關的biomarkers

利用差異分析方法，找到疾病組和健康組顯著差異的微生物，使用差異的微生物構建疾病監測模型，或者可以驗證該差異物種是否是引起疾病的因素。

3.1 構建疾病監測模型

Bedarf等研究帕金森患者和健康人腸道菌群上的功能差異時，發現了6種差異的KEGG modules，為了確定哪種微生物在帕金森病中起關鍵作用，文章將基因進行了物種注釋，發現微生物Eubacterium在帕金森患者中顯著升高，用Eubacterium構建帕金森患者的疾病監測模型，AUC達到63%，合併其它五種差異微生物構建帕金森患者的疾病監測模型，AUC達到84%[3]。

圖4. 帕金森患者疾病監測模型

銳翌基因與浙江中醫藥大學合作項目使用宏基因組研究強直性脊柱炎（AS）患者腸道菌群，使用3種方法挑選AS疾病的biomarkers，分別是33個物種markers、30個基因markers和62個clusters makers，構建AS疾病診斷的分類模型，在驗證組中三種方法構建的AS分類模型的AUC分別為93.55%、96.64%和92.61%[4]。

圖5. 強直性脊柱炎（AS）患者疾病監測模型

用biomarkers構建疾病監測模型的文獻，都不是低分的文章，你的文章中是否也需要該方法錦上添花呢？

3.2 驗證biomarkers是否是引起疾病的原因

3.2.1 分離菌株，使用菌群移植的方式在模式小鼠中進行驗證。

Buffington等比較高脂飲食孕期小鼠後代與正常飲食孕期小鼠後代的腸道菌群，發現Lactobacillus reuteri（羅伊氏乳桿菌）在正常飲食孕期小鼠後代中丰度顯著高於高脂飲食孕期小鼠後代，假設該菌是引起高脂飲食孕期小鼠後代社會行為障礙的原因。給4周的高脂飲食孕期小鼠後代飼餵羅伊氏乳桿菌後，檢測小鼠的社會行為，發現其可以明顯改善後代自閉症癥狀。並且從催產素水平和神經元活性深入研究探討了羅伊氏乳桿菌改變小鼠的社會行為的機制[2]。

圖6. 羅伊氏乳桿菌移植實驗及移植後小鼠社會行為檢測

3.2.2 基於宏基因組基因組裝，組裝菌株。

Heintz‐Buschart等使用16S測序比較健康人與疾病組時，，發現10個顯著差異的OTUs沒有物種注釋信息，繼而使用宏基因組數據組裝其基因組，進行功能挖掘。對OTU_469和OTU_171（均在PD患者中丰度低）進行基因組組裝，結果發現OTU_171屬於Cyanobacteria門Melainabacteria科，Cyanobacteria可以產生神經毒素，與神經性疾病相關。OTU_171菌株與同一種水平的產毒素菌株競爭，具有保護性作用；OTU_469菌株與aSyn相似，具有保護性作用，闡明帕金森患病的機制[5]。

圖7. 差異物種基因組組裝

小銳總結的這些研究思路，都頻繁地出現在高影響因子的文章中。希望它們給您帶來靈感，助力深入挖掘腸道微生物與疾病之間的關係。

參考文獻：

[1] Schnorr S L, Candela M, Rampelli S, et al. Gut microbiome of the Hadza hunter-gatherers.[J]. Nature Communications, 2014, 5(3654):3654.

[2] Buffington S A, Di P G, Auchtung T A, et al. Microbial Reconstitution Reverses Maternal Diet-Induced Social and Synaptic Deficits in Offspring.[J]. Cell, 2016, 165(7):1762.

[3] Bedarf J R, Hildebrand F, Coelho L P, et al. Functional implications of microbial and viral gut metagenome changes in early stage L-DOPA-na?ve Parkinson』s disease patients[J]. Genome Medicine, 2017, 9(1):61.

[4] Wen C, Zhang Z, Shao T, et al. Quantitative metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis[J]. Genome Biology, 2017, 18(1): 142.

[5] Heintz‐Buschart A, Pandey U, Wicke T, et al. The nasal and gut microbiome in Parkinsons disease and idiopathic rapid eye movement sleep behavior disorder[J]. Movement Disorders Official Journal of the Movement Disorder Society, 2017.

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