Duchenne肌營養不良的基因診斷策略及國際最新治療進展

我們知道有很多病以人名字來命名，是為了紀念這位醫生。DMD就是為了紀念Duchenne醫生，他是法國人，神經內科的先驅，主要活躍在19世紀，發展了肌電圖，醫學照相，組織活檢等多項技術。大家是不是覺得，Duchenne醫生一定報道了第一個病例吧？這樣我們才紀念他。其實不是。歷史上，第一個DMD病例其實是由兩位亞洲尼泊爾醫生首先報道的。為什麼這兩位醫生在醫學史上沒能夠留下他們的姓名。反而是十幾年後的Duchennne更廣為我們所知呢，第一個原因是當時的法國是醫學，尤其是神經內科的研究中心，Duchenne的研究引起了更多人的關注，另一個原因是因為Duchennne醫生進行了非常詳細，並且直觀的報道。

這張照片就是Duchenne報道的病人，一個典型的DMD男孩。DMD是最常見的罕見病了，報道的發病率在每3000到6000個男孩中就有一個病人。一般起病年齡在2歲到6歲之間，發病之後肌力是明顯弱於同齡人，不加以治療的話，到了青春期就只能依靠輪椅來活動了。由於肌肉細胞被不斷地破壞，CK的水平是非常高的。

對於這樣一個比較常見的罕見病，早期認識DMD就非常重要了。如果我們在門診遇到發育遲緩，遲遲不會走路的幾歲男孩，或者高爾征陽性，或者步態異常或肌力很弱，小腿肌肉異常肥大，再檢查發現CK水平很高，就應該高度懷疑DMD，進行下一步檢查。

DMD是由dystrophin基因變異導致的遺傳病。這個基因位於X染色體的短臂，是一個很大的基因，約有2.4 兆鹼基對。每一個藍色的方格代表這一個外顯子，一共有有79個外顯子。外顯子的弧線或者直線，表示著氨基酸編碼閱讀框的順序。

DMD的遺傳方式符合伴性遺傳，也就是X連鎖的隱性遺傳。一個家庭中的DMD患病男孩，我們稱之為先證者。由於女性有兩個X染色體，所以母親叫做攜帶者。而男性由於只有一個X染色體，如果這個拷貝有變異，比如這位先證者，就會發病。而如果兒子沒有從母親那裡遺傳到這個有變異的X染色體，那麼他就是正常的，不發病。

dystrophin這樣一個巨大的基因，編碼的產物也不只有一種，有長有短。最長產物的Dp427就有骨骼肌，心肌，浦肯野纖維這三種不同的轉錄本。。稍微短的一些產物分布在其他不同的組織，例如視網膜，腦部。所以，這也是為什麼DMD會影響心臟以及DMD患者也可能出現神經發育問題的生理基礎。更短的一些產物還需要我們進行進一步的研究。

我們已經知道Dystrophin基因是很大的一個基因，相應的， Dystrophin蛋白也是很大的一個蛋白，有427k道爾頓。這個蛋白位於肌細胞膜的內側面，一側連接在actin肌動蛋白上，另一側連接著肌細胞膜上的蛋白質複合體，通過這個蛋白質複合體固定在細胞外基質上。另一方面，dystrophin連接著細胞骨架 microtubules。在肌肉的收縮過程中，發揮穩定細胞結構的作用。我們可以把Dystrophin看成穩定船的錨繩。 DMD疾病呢，就是這個錨繩斷開了，船無法被有效地固定起來。

接下來我們來了解一下都有哪些致病突變會導致錨繩斷開。這個圖表基於eDystrophin網站的統計，我們看到，絕大部分的DMD都是由片段缺失，也就是deletion導致的，佔到了64% ，片段重複佔到了超過21%。由於片段的缺失或者重複，導致編碼氨基酸的編碼框的閱讀位置被改變，這樣翻譯出的多肽鏈的氨基酸順序和正常的順序完全不同，翻譯也提前終止，這樣的dystrophin蛋白就喪失了正常功能。

有些DMD是由無義突變，英文叫做nonsense導致的。由於這個提前出現的終止密碼子，dystrophin蛋白的翻譯被提前終止了，這樣的不成熟產物既沒有功能，也更加不穩定，更容易被細胞降解掉。

Dystrophin蛋白缺失導致DMD的病理機制是一個很複雜的表格。我們還是用錨繩斷開這個模型來幫助理解。普通人的肌肉由於有這個錨繩的固定作用，肌肉細胞能夠正常收縮，我們可以進行正常的行走，運動等等。DMD病人由於這個錨繩的斷開，普通的肌肉收縮比如呼吸、走路，對他們來說就會導致肌肉損傷，從而引發炎症反應、肌肉纖維化、反覆破壞與再生等一系列的反應，最終導致肌肉不具備正常的收縮功能。

如果錨繩沒有斷開，而只是縮短了呢？這就是Becker型肌營養不良。Duchenne型患者是完全缺失正常功能的Dystrophin蛋白。Becker型患者，Dystrophin蛋白一般存在部分功能的.

相對於Duchenne型，Becker型患者起病比較遲，一般是兒童期，也有到成年期才發病的，病情進展也更加緩慢一些，20歲之後才需要依賴輪椅，當然也有不需要依賴輪椅的。由於肌肉損傷沒有那麼嚴重，CK升高一般在5倍左右。除了Duchenne，Becker這兩種影響骨骼肌的疾病之外，dystrophin還可能會僅僅影響心臟，也就是DMD相關性擴張性心肌病

我們一般認為女性攜帶者不發病。一項2016年的研究調查了15位攜帶者，8位沒有臨床癥狀，僅僅有CK升高，另外7位有輕微的癥狀，比如：肢帶肌力下降，步態異常，運動不耐受。也有攜帶者肌電圖有異常的。

和大家分享一下我自己的一個病例。這是個11歲女孩，沒有臨床癥狀，體檢發現CK升高。肌活檢提示Calpain3蛋白可疑性降低，所以他們去進行了CAPN3基因測序，結果是正常的。接著父母和孩子來我們這裡做全外測序分析，我們找到了一個DMD基因上的 de novo無義突變。所以最後我建議治療醫生回頭去確認一下肌活檢，同時這個女孩長大了之後如果生育男孩的話，也是有DMD的患病風險的。

探討完了機制，接下來進入診斷環節。我們可以在基因水平檢測，也可以在蛋白水平檢測，請問各位，大家覺得哪一種方法應該是首選呢？

這個答案其實一直都在變化。在測序普及之前，傳統的檢測方法一直是肌肉活檢。從患者身上取一塊肌肉下來，在實驗室里進行組織固定，切片。

診斷金標準是免疫組化，進行抗dystrophin抗體染色。我當時的實驗室有4種不同的抗體，針對不同的結構域都要做。左邊的是正常的肌肉切片，我們可以看到清晰的肌纖維，形態是正常成簇的。右邊的是DMD肌肉切片，dystrophin蛋白是明顯缺失的，肌纖維的形態也不是正常狀態。

隨著NGS時代的來臨，基因檢測走進了臨床實踐。這個診斷步驟取自2010年發表的DMD診斷指南。我們看到，懷疑DMD，可以跳過肌活檢直接進行基因檢測，基因檢測的方案呢，首先進行片段缺失與重複的分析，陰性結果的話，進行下一步的測序分析。如果發現了致病變異，診斷確定，不需要再進行活檢了。而反之，肌活檢確定了蛋白異常，基因檢測則是必須的步驟。

隨著技術的進步，我們實際上可以不再遵守先缺失與重複分析，再進行基因測序的步驟。NGS測序的數據，在保證足夠的測序深度的情況下，是可以提示片段缺失的。我自己在工作中就這樣發現了好幾例，最終MLPA也驗證了病人的片段缺失。MLPA方法是檢測片段缺失與重複的金標準。為什麼我在這裡和大家討論未來NGS與MLPA的順序互換呢？費用Money~很多DMD的孩子，家境困難。由於國情所限，費用問題常常是我們醫生在臨床上需要面對的實際問題。MLPA作為金標準，試劑是MLC Holland公司的專利產品，費用不低。而NGS測序的費用逐年下降。因此，在可以預見的未來幾年，我個人相信，也期望NGS測序數據能夠為診斷片段缺失與重複發揮更大的作用。

那麼現在問題來了，病人確診了DMD，應該如何治療呢？

在談治療方案之前，我們先來關心一下費用。2017年一篇文章的表格給我們提供了發達國家的數據。我們看到像德國，義大利，英國美國這些國家，一個病人一年的費用都在幾萬。這還只是直接的像藥費，護理費這些，不包括家庭護理的負擔。大家都是臨床醫生，根據大家經驗，這個病每年費用是多少呢？希望有經驗的老師等會可以和我們分享一下。

具體的治療我們需要參考TREAT-NMD的指南。TREAT-NMD是歐盟支持的一個專註於神經肌病的知識庫，提供像DMD，SMA，CMD等等病的診斷指南，家庭護理指南，研究進展等一系列的知識。對神經肌病有興趣的老師可以經常關注一下這個網站。DMD有2010年發表的很系統的治療指南，可以在他們的網站上查看英文全文。也有一個簡略版本，歸納了診治要點 。協和醫院的戴毅老師把它翻譯成中文。

最重要的幾點包括：第一，參加患者肌病組織，從組織中獲得支持和幫助。我們國內有李衛國老師負責的DMD關愛協會。第二，是激素治療，需要對家長進行解釋，早期應用。第三呢，是多學科的綜合治療，包括心臟監測，骨科骨密度，關節功能，呼吸功能，心理健康等等。這個一方面需要綜合醫院建設這樣的綜合治療門診，聚集多學科的專家，另外一方面又回到了費用問題，患者是否可以負擔的起。

在充分認識了DMD的致病突變之後呢，製藥公司們也在積極開發新治療方案 。

首先給大家介紹的是針對片段缺失，外顯子缺失的 exonskipping方案。

我們先來詳細看一下exonskipping，外顯子跳躍的治療原理。正常情況下全部外顯子是被依次翻譯的。deletion造成某個外顯子，或者幾個外顯子缺失。以49號50號外顯子缺失為例，這兩個外顯子缺失之後，編碼氨基酸的編碼框的閱讀位置被改變，這樣翻譯出的多肽鏈的氨基酸順序和正常的順序完全不同，翻譯也提前終止，蛋白產物就沒有了正常功能。這個Eteplirsen 是反義寡聚核苷酸，剛好有針對性的結合到51號外顯子上，把這個外顯子就屏蔽掉了，因此，直接從48號外顯子就跳到52號外顯子，氨基酸的閱讀框恢復，蛋白質等於說變短了一些，但是還是有部分功能。等於把Duchenne的病人變成了Becker型。

Eteplirsen是Sarepta公司開發的一種注射葯。研究發現大約13%的病人是由這兩個外顯子缺失導致的，所以這個葯還是有一定的患者人群。在II期臨床試驗，治療效果是很明顯的，dystrophin蛋白的表達量在72%的患者中都上升了。這個葯2016年已經通過了FDA的審批。

我們前邊介紹無義突變，提前出現的終止密碼子，dystrophin蛋白的翻譯被提前終止了，這樣的不成熟產物既沒有功能，也更加不穩定，更容易被細胞降解掉。一個叫Ataluren的新葯就是針對提前出現的終止密碼子的。

這個分子是特異性識別提前出現的密碼子，核糖體也是被屏蔽掉，所以翻譯就會繼續下去，知道正常的密碼子出現，翻譯終止。這樣呢，蛋白質就能夠被重新正確地表達出來。

Ataluren的臨床試驗是一波多折。最初沒有限制患者的年齡，所以二期臨床沒有觀察到6分鐘行走實驗的明顯改善。經過幾年的反覆數據分析，對DMD疾病進展更深入的觀察，他們重新設計的臨床試驗獲得了成功。2016年這個葯在德國已經上市，仍屬於臨床試驗期，售價非常昂貴，一年費用是幾百萬歐元。但是，由於歐洲葯監局認定，進入了法定醫療保險的範圍，所以符合條件的患者可以使用這個藥物。條件就是基因檢測確定患者攜帶nonsense突變，並且年齡小於6歲。優點是-口服給葯。

這就是我們今天的內容。在疾病的機制環節，我們了解了DMD是X染色體上的基因，dystrophin蛋白位於肌細胞膜內側，發揮錨繩類似的固定作用。也了解了Duchenne型，Becker型肌營養不良的不同，以及女性攜帶者。在診斷環節，分別介紹了肌活檢和基因診斷的方法。治療部分，外顯子跳躍的藥物是針對片段缺失的，Ataluren是針對無義突變的。

謝謝大家的參與！