視頻|分子克隆操作詳解

05-14

以下為視頻文字內容，請點擊下面鏈接查看視頻：

視頻|分子克隆操作詳解 - BioEngX

分子克隆是將來源於原核或真核的重組DNA插入一個可以複製的載體，如質粒或病毒載體中的一項技術。克隆是指製備大量拷貝的的目的DNA片段，比如一個基因。在這段視頻中，您將了解分子克隆的不同步驟，如何進行操作，以及該技術的不同應用。

基本原理

克隆開始前，至少需要準備兩個重要的DNA分子。首先，也是最重要的，是您想要克隆的DNA片段，也被成為插入片段。它可以是來自原核細胞，真核細胞，或者一種絕跡的生物，或者也可以在實驗室中人工合成。通過分子克隆技術，我們可以對該基因的功能有更多的了解。

其次，你需要一個載體。載體是一種質粒DNA，在分子生物學中的被用作工具，來製備某個基因的大量拷貝。或者用來合成該基因編碼的蛋白質。質粒就是載體的一種，它是獨立於染色體的環狀DNA，可以被細菌複製。

質粒通常具有多克隆位點MCS，此區域包含不同的限制性核酸內切酶也稱為限制酶的識別位點。不同的插入片段可以通過一種叫鏈接的技術被整合到質粒中。質粒載體還含有複製起點，使得質粒能夠在細菌中複製。此外，質粒還具有抗生素抗性基因。當細菌含有該質粒時，它就可以在包含抗生素的培養基上存活。這樣就幫助篩選了成功轉化的細菌。

插入片段和載體被導入宿主細胞種。分子克隆中最常見的宿主細胞是大腸桿菌，它生長迅速，可普遍獲得，並且有有許多不同的克隆載體被商品化。真核生物如酵母也可以被用來作為一種宿主細胞。

普通分子克隆的第一步是獲得想要的目的片段。它可以是來自於任何細胞類型的DNA或mRNA。根據插入片段類型和最終目的選擇最佳載體和宿主細胞。通常使用基於PCR的方法來複制插入片段。然後通過一系列的酶促反應將插入片段與載體連和到一起，再導入到宿主細胞，來得到大量複製。複製後的載體從細菌中純化出來，經過限制性酶消化，在電泳膠上進行分析。將純化得到片段送去測序，來驗證插入片段是所需DNA片段。

操作過程

讓我們更詳細一點看看如何進行分子克隆。在開始任何克隆實驗前，需要計劃好您的克隆方案。例如，任何一個質粒載體都只有有限的幾個限制性酶切位點，用於將插入片段整合到多克隆位點中。你要選擇一個在插入片段種沒有的酶切位點，以防止片段被切開。您還有可能面臨到連接一個帶平端的片段和帶有粘性末端的片段的情況。這時唯一的選擇是，使用Klenow片段將突出端補平。然後用平末端連接，將插入片段放入到你想要的載體中。

分子克隆中的DNA可以是來自於任何細胞或是組織樣品，通過簡單的提取技術即可得到。提取之後，可以使用PCR來擴增插入片段。擴增之後，使用限制性內切酶對片段和載體進行酶切。酶切後，可對片段和載體進行電泳，並用凝膠純化進行純化回收。對於載體，這一步有助於分離酶切後的線性質粒和未被酶切的質粒。未被酶切的質粒，在凝膠上顯示的一個高分子量的模糊帶型。

酶切後，使用DNA連接酶將插入片段連接到質粒中。通常來講，連接反應中的插入片段和載體的比例最好是3:1，這樣可以保證只有少量的載體會發生自連。連接反應在冰上準備好後，可以在14-25?C下孵育1小時或直至過夜。

接下來進行轉化，將質粒載體倒入宿主中進行複製。將轉化後的細菌塗板到含抗生素的瓊脂板上，37℃培養過夜。由於質粒包含了一個抗生素抗性基因，被成功轉化的細菌在抗生素存在時，會生長形成菌落。可從轉化板中挑取多個單克隆，接種到含有培養基的編號的管中，然後在搖床培養箱中擴增。少量的培養物用來在編號的瓊脂板上塗板，剩餘的用於質粒純化。

經過純化的質粒先用限制性酶進行切割，酶切產物進行凝膠電泳，以檢查插入片段的存在。這樣我們可以驗證細菌菌落是被轉化了含插入片段的質粒，還是轉化了自連的質粒。被證明轉化了插入片段的質粒可以用來擴大培養，以便進一步進行質粒純化。測序用於最後驗證目的基因得到了克隆。

應用

克隆可以有無數的應用。例如，當一個mRNA模版在反轉錄酶的作用下，經過反轉錄得到cDNA或者互補DNA，然後可使用PCR擴增該cDNA。這樣通過分子克隆技術我們創建了一個cDNA文庫，這一文庫中包含某特定細胞類型中所有表達的基因。

分子克隆還能用來克隆一系列基因，或者來源於一個細菌菌株的基因簇。將它們重新組合到質粒上，在轉化到另一個菌株中，這樣可以重建整個生物合成途徑，來生產複合物分子。

分子克隆可通過在一種特殊細菌菌株中，表達目的質粒來生成突變體文庫，因為該菌株在特定溫度下會使用易錯聚合酶。用測序來鑒定這些突變體，然後用不同的藥物或化學試劑來測試含突變基因的細菌轉化體，看哪些細菌克隆產生了藥物抗性。

分子克隆能將報告基因嵌入到DNA載體中。常見的報告基因是綠色熒光蛋白GFP，它在紫外燈照射下可發出綠色熒光。報告基因還可被插入到腺病毒中，來顯示蚊子的轉染和它在細胞中的可遺傳性。

結語

以上為JoVEs視頻的文字部分，您現在應該了解了如何操作分子克隆，以及該技術是如何在分子生物學中得到應用。感謝收看！

作者：JoVE，JoVE is the worlds first and only peer-reviewed scientific video journal that increases productivity.

Peer Reviewed Scientific Video Journal - Methods and Protocols