【工具】Gateway設計ishRNA（總）

想不想設計一個帶著開關的基因敲低呢？

今天來給大家講講用gateway的方法來設計ishRNA。

整個流程如下：

上圖概括一下：

1. 設計Oligo
2. Annealing，形成雙鏈
3. Ligation 連入pENTR/H1/TO， 用E.coli TOP10 kanamycin篩選，找到正確的克隆。

pENTR攜帶attL site和tetO2，但不具備製作病毒的要素，因此只能用於transient transfection，而且需要目標細胞有表達TetR。因此我們還需要進一步找一個有病毒部件和attR 的destination vector。

這裡我找了一個叫pLIX的vector，它的特點是：

• 攜帶attR，可與attL 進行LR反應。
• 有ccdB，確保只有LR反應成功的vector才可以生成colony.
• 自帶rTetR，算是一個All in one的vector
• 有tet operator，雖說我們已經在pENTR上有了tetO2,但是這上面還有更多的。
• 可以進行puromycine selection
• 最重要的是，擁有lentiviral的系統。

有了Destination vector, 我們就可以用之前做好的pENTR來進行LR反應了。

LR反應的原理如下：

最後會合成expression vector。

讓我們放大shRNA部分來看一看的話，就是下圖：

這裡可以發現在進行完LR反應之後，gateway site變成了attB。

合成了expression vector之後，我們就可以包病毒了，然後進行transduction，以及puromycin 篩選。

最後一個穩定表達ishRNA的細胞就做好了，你可以盡情地調教它了

——開，關，開，關，開，關。。。。

是不是很興奮呢？嘻嘻。

（下一章我們詳細介紹如何設計Oligo）