【科普】ccdB篩選

很多小夥伴做clone的時候都有不少困擾，尤其是在挑colony的時候，會挑出很多空載體。

如何能讓空載體消失，而只讓clone成功的colony生長呢？

傳統的clone目前不能做到，但是用gateway的方法就可以做到。

Gateway的核心之一就是利用ccdB的毒性，從而達到negative selection.

ccdB是一種DNA gyrase， 其工作原理如下圖：

它能讓DNA的超螺旋結構變成逆向螺旋，因此對E.coli具有毒性。

Gateway如何利用它的毒性呢？

上圖是一個LR反應，可以看見，如果clone成功的話，destination的ccdB將被一個基因替換掉，而最終產物將不攜帶ccdB基因。

正常的clone並不能保證100%的成功率，往往有很多空載體被同時轉入進E.coli。

空載體攜帶ccdB，E.coli攜帶ccdB的話，將不能生長。

因此最後，能生成colony的，只能是來自於不攜帶ccdB基因的成功載體的細菌。

了解了gateway的篩選方法，我們再來聊聊關於適合gateway的E.coli strain。

除了ccdB，還有一個蛋白叫ccdA。ccdA可以抑制ccdB。

因此如果這個E.coli里同時有ccdA的話，整個篩選將毫無意義。

不攜帶ccdA(F episome)的E.coli有： TOP10, DH5α, DH10B

上面這些可以用於BP,LR反應後的transformation。

對ccdB有免疫力的有：DB3.1， 和ccdB survival(綠蓋子)

這些E.coli可以用於對那些攜帶ccdB載體（比如donor vector和destination vector）的擴增。