CRISPR系統應用中存在的巨大隱患:「內源性gRNA」

本文只是個人在使用基因編輯系統以來，個人主觀感受。只是粗暴的提出一個討論和研究的角度，歡迎大家讚賞以及扔臭雞蛋，歡迎有有研究背景的個人或者機構在線上及線下探討。

最近幾天，各生物醫藥公眾號及科技新聞都在轉發Nature Methods雜誌這篇文章「Unexpected mutationsafter CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods 2017; 14:547-548」及相關消息。對文章的解讀及評論可以參看中科院上海神經科學研究所研究員楊輝和他的博士研究生唐騁發表在微信公眾號「知識分子」上的文章「CRISPR大範圍「脫靶」？可能還需要進一步驗證」。還可以看看Xiaolin Wu在Pubmed上的Comment https://www.ncbi.nlm.nih.gov/myncbi/xiaolin.wu.1/comments/，Wu老師（不是我）發現了這篇文章數據的很多問題，進而懷疑主要數據的可靠性，很值得一看。

以下是本人的一些想法，而這些想法是基於使用基因編輯系統經驗以及這篇數據存疑文章的啟發，以下均為個人推測，而且很有可能是「過度推測」。

正如很多同行意識到的，這篇「通信（correspondence）」文章，在技術上有相當多的缺陷，比如，樣本數量太少（小鼠，sgRNA種類），對照設置不合理（兩隻實驗組，測序深度50x;一隻對照組，測序深度30x），使用CRISPR方法上也有問題，文章數據明顯錯誤等等，但是這篇不靠譜的文章，卻提出了一個非常尖銳的問題，我們現在使用的檢測off-target手段是否合適。現在一般流行的預測off-target的方法，均是用gRNA-target序列（guide sequence，通常20bp）在基因組資料庫中進行同源比對，結合gRNA-target序列每個位點的重要性不同，給出off-target位點可能性打分，在對目的基因位點編輯後，確認off-target高分位點是否有突變。

Hyongbum Kim, Jin-Soo Kim. Nature Reviews Genetics, 15,321–334 (2014)。

CRISPR系統用短小的gRNA引導Cas9/Cpf1/C2c2等對目的位點進行基因編輯，可編程，易操作，可規模化，費用低等一系列的優勢，成為基因功能研究及篩選的利器（圖1）。但每個稍有分子生物學知識的人都會心存疑慮：細胞中自身大量的各種各樣的RNA，比如miRNA，mRNA等轉錄及成熟過程，能否發揮類似gRNA的功能。做個最簡單的比對實驗，用大家最常用的CRISPR系統表達質粒pX330（from MIT張峰實驗室）為例（圖2），我們知道gRNA序列分為兩個部分：guidesequence（gRNA-target序列，pX330質粒中Bbs I雙酶切插入的針對基因組位點序列，對應自然條件下，細菌系統中的traceRNA），以及gRNA scaffold（spCas9通用的骨架，二級結構對Cas9蛋白構想發揮重要作用，對應自然條件下細菌系統中的crRNA），以其gRNA scaffold 序列76bp（圖2藍色部分）在NCBI blast資料庫中進行比對：網站：Basic Local Alignment Search Tool，Database：Human genomic plus transcript（Human G+T），Program Selection：Somewhat similarsequences (blastn)，其他參數默認，得到部分的結果（圖3）

而在Database：Mouse genomic plus transcript（Mouse G+T）中，得到部分的結果（圖4）。

圖4. PX330-gRNA scaffold 序列在NCBI blast資料庫Mouse genomic plustranscript（Mouse G+T）比對部分結果。

從這些比對結果（圖3，圖4）可以看出，人和小鼠細胞內具有作為gRNA scalford的潛力。當然，這些都是斷斷續續的，能不能作為gRNA scalford沒有實驗數據證據，但是大家應該要注意的是，gRNA是自身形成二級結構再發揮功能，並不需要序列完全一致，只要二級結構保守，理論上，它就可以作為gRNA與Cas9蛋白相互作用（從這個方面來說，具有RNA酶活性，能自我產生gRNA的Cpf1有更大的問題）。另外，自然條件下，traceRNA與crRNA是分開的，那另一個潛在的問題就是，我們外源倒入的gRNA有沒有可能作為骨架，讓細胞內其他的RNA片段作為traceRNA從而導致off-target？如果以上問題存在，現有的預測off-target位點演算法將受到完整性的挑戰。另外，這篇文章「Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods2017; 14:547-548」數據顯示F03和F05小鼠off-target形成的SNV和Indels位點高度重疊性（圖5）。如果數據是可靠的話，我們在上面的推測基礎上，再往前推一下：由於這兩隻老鼠親緣關係，發育時間等各種條件的一致性，細胞內表達的RNA具有高度一致性，所產生的「內源性gRNA」一致，所以導致off-target位點的一致性。這個同樣沒有實驗數據，如果有實驗條件，可以將RNA-seq和WGS相結合，處理不同條件下的樣本進行分析，會得出結論。

Fig 5. CRISPR gene correction introduces anunexpectedly high number of mutations in a mouse model of gene therapy.

除off-target研究有更多的後續工作，對於自然條件下的CRISPR系統，我們還是了解的太少，而從文章發表量來看，80%以上的文章都是應用型的文章。但很多基礎理論並不清楚，如對於以前沒有的spacer序列，細菌是如何檢查的？細菌本身是否允許CRISPR系統在一定程度上對自身基因組進行「改造」（off-target），從而快速進化？最近研究發現，細菌體內有抑制Cas9活性的蛋白（AcrIIA2，AcrIIA4），但並不是100%抑制（Inhibition of CRISPR-Cas9 withBacteriophage Proteins，2017，Cell），更有甚者，RNA-target CRISPR系統C2c2在將目的RNA切除的同時，還將細胞里其他RNA給講解，從而導致細菌自身進入休眠狀態（C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targetingCRISPR effector，2016，Science）。

我們該如何應對？(a)毋庸置疑，我們需要更多的研究，off-target的研究，CRISPR機理研究。(b)對於應用上，我們需要更加的小心。我們需要更多其他實驗進行驗證，比如我們可以使用TALEN系統進行重複敲除驗證。TALEN的原理是基於蛋白結構識別不同鹼基，理論上，不存在「內源性」問題，TALEN應該從CRIPSR系統中的陰影中走出來，需要更多的研究及使用。（c）對於臨床應用，應該更為謹慎，由於ZFN在前，我認為現階段TALEN更為合適。

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