測序之前篇： NGS測序中，接頭是如何添加上的，以及如何去接頭

我見過的相當一部分人，做質控時，一般也就就是跑個實驗室或者公司的祖傳代碼，但對於軟體所做的操作不求甚解，歸根結底，是因為對測序流程中，接頭是怎麼加上去的不太了解。

現在我們接觸的大多數二代測序數據，都是來自於illumina測序平台。這其中，大多數illumina文庫的構建，是通過將接頭連接到fragment DNA/cDNA的兩端（但是Nextera方法除外，因為技術相對不常見，這裡不深入展開）。 下圖是一張很經典的加接頭的示意圖，圖片下載於網頁 http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq

正如圖所示，大概分為如下步驟。

• 用酶或者激光或者超聲波將Genomic DNA或者由RNA反轉組得到的雙鏈cDNAs打斷成小片段
• 打斷是隨機打斷，有可能末端不平整，還需要用酶補平
• 補平之後，需要在3』端加A鹼基
• 加上A之後，再加adapter

這時候，我們好像心裡有那麼點數，但是依然不知道adapter具體是怎麼加上去的，也並不知道接頭中，read1 sequncing primer, index, read2 sequencing primer,以及index sequencing primer到底在接頭的什麼地方。

那，是時候放出這張圖了。

看完這張圖，我們感覺對接頭的添加這個過程的理解，好像多了幾分。如果我們看上面這兩張圖，感覺就是在fragment DNA兩端直接加了一個Y字形的引物，它被稱人稱為Full Y-adapter或者forked adapters。

但我們如果看illumina的官方視頻，能夠看到如下幾幀介紹。

（上面的圖是我從視頻里截取下來，文字是根據我聽到的加上去的）

從圖片中我們能夠看到，在「接頭」添加之前，接頭上好像已經有另一個叉形接頭了，那這是咋回事呢？ Y形接頭不是直接添加到DNA fragment上的嗎？

其實這是兩種不同的indexing strategy導致的差異， 而這兩種strategy的示意圖，如下圖所示。

左邊的是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經包括了和P5/P7 oligo互補的序列, index, 以及Read1/Read2的測序引物。

右邊的那種是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然後再引入和P5/P7 oligo互補配對的序列以及index序列。

一句話總結，這兩種不同的indexing strategy的差別在於引入index序列的時機和方式不一樣。

其實右邊的圖並不是畫的特別形象，具體的的可以參看下面這張圖，圖片的來源是https://www.fimm.fi/en/services/technology-centre/sequencing/next-generation-sequencing/dna-library-preparation

在這裡我們能夠清楚地看到，這種接頭添加過程中，fragment DNA兩端是先連上PE adapter, 然後再通過PCR引入的region complementary to P5/P7 sequence, index, and sequencing biding sites.

如果你的序列含有TruSeq Universal Adapter, 這時候可以採用如下去接頭的代碼。至於如何判斷你的序列里到底有沒有TruSeq Universal Adapter，可以下次單獨寫一篇來講解。

去接頭代碼：

cutadapt --times 1 -e 0.1 -O 3 -m 30 -q 25,25 -u 8 -a AGATCGGAAGAGC -A AGATCGGAAGAGC -o trimmed.1.fastq.gz -p trimmed.2.fastq.gz reads.1.fastq.gz reads.2.fastq.gz

我們今天的收穫是：

• illumina文庫構建的一般方式
• illumina接頭的兩種添加方式（兩種不同的indexing strategies）
• 如何用cutadapt去除TruSeq Universal Adapter

只是一個很小的細節，我們就討論了這麼多，今天就討論到這裡，下次我們再接著結合illumina官網的序列，用實實在在的鹼基序列示意圖來講解，為什麼要這麼來去接頭。

附上illumina官網的測序原理介紹視頻如下：

參考鏈接:

1. 圖一來源

2. illumina adapter 文件

3. 圖五來源