植物組織培養入門

05-12

就像我們可以把核酸提取這樣一類分子生物學實驗粗暴地劃分成細胞裂解和核酸純化兩個步驟一樣，植物組織培養也有兩個核心的步驟，那就是野生材料馴化和組織形態建成。

野生材料的馴化

很多時候，需要使用植物組織培養往往是出於遺傳轉化受體的需要，抑或是進行不同條件的培養以提取代謝物進行差異分析，出於這樣的前提，實驗者往往只是搬照文獻里給出的培養條件或者做出明確的改動，缺乏的只是材料。

因此，無菌培養是這一類組織培養實驗的保障，而將野生材料馴化的過程，即是無菌操作與外植體消毒等一系列與污染作鬥爭的集中體現。

野生材料馴化的具體措施如下：

1. 滅菌：

通常，我們需要對使用的培養基、培養皿、鑷子、解剖刀、去離子水和濾紙進行徹底的滅菌，這樣可以徹底殺死器材和培養基中的微生物；

其中，培養基、鑷子、解剖刀、去離子水等液體和金屬器皿通常採用121℃ 20-30min的濕熱滅菌法，玻璃器皿常用180℃ 2h的乾熱滅菌法，而抗生素、激素等不耐高溫的試劑常用過濾滅菌法。

2. 消毒：

消毒是指外植體和操作檯面的消毒，目的是在不傷害植物的前提下，抑制和殺死大部分微生物。其中，外植體消毒的方式主要分為表面消毒和侵入消毒兩種，對於操作檯面的消毒通常是指超凈工作台使用前進行的的30min紫外燈消毒和操作過程中的空氣濾過消毒，值得一提的是，在使用超凈台之前用70 % 酒精擦拭檯面會有一定效果。

對於大部分種子、陸生植物的莖葉等，表面消毒足以殺死可能會在組織培養過程中導致污染的微生物，比如70 % 乙醇、5 % 過氧化氫，均可以在短時間內有效殺死表面的微生物；

但對於一些生長在潮濕陰暗環境中的植物來說，通常有著大量的組織內生菌，而這些內生菌往往不是表面消毒可以殺死的，一些侵入式消毒劑會比較有效，如升汞、次氯酸鈉等。

3. 無菌操作：

無菌操作即杜絕一切來自操作者的污染或因操作者失誤導致的其他污染，一些常見的操作手法如下：

a) 設立單獨的組培間，並設立與外界污染區的緩衝間，在緩衝間內更衣進入組培間；

b) 進入組培間前要在緩衝間內進行全身的酒精噴霧消毒，同時換上組培室專用拖鞋；

c) 操作過程中，佩戴手套或肢體不從一切開口器皿的上方經過；

d) 器皿不要遮蓋超凈台出風口，超凈台不要開口太大；

e) 在超凈台中點燃酒精燈，操作盡量在酒精燈火焰周圍進行；

f) 使用的金屬工具和玻璃器皿每進行一階段的操作後及時進行灼燒滅菌；

g) 鑷子、槍頭等接觸培養基的工具在接觸到其他固態表面後立即灼燒滅菌或更換；

h) 做其他分子實驗的超凈台應與進行組織培養接種的超凈台分開；

4. 富內生菌類型的野生材料的馴化

部分野生材料難以實現有效的消毒，即便是兩種消毒方法複合使用也收效甚微，此時應使用試管苗培養的方法，大批量接種培養，經過兩周後篩選未污染的植株再進行擴大培養，此方法可有效馴化野生植株獲得無菌系，一些苔蘚植物常用這樣的方法。注意，在培養過程中一旦發生污染，整個培養基的植株都應該丟棄。

如果與內生菌的鬥爭過於艱難，可以嘗試使用組織培養抗菌劑PPM，這是一種廣譜的抗菌劑，但是也會對某些植物有著抑制效果，建議在馴化獲得無菌系之後停止使用。

組織形態建成

在一些其他的時候，我們需要對一些從未進行過組織培養的植物進行人工的繁育，以適應實驗的需求，在這個時候，我們往往需要自己進行組織形態建成的探究。

正確的改變培養條件，是建成想要的組織形態的一種策略。

首先要說明的是，在更換培養基的時候，需徹底清除殘餘的培養基並將植株剪切或者其他方式進行處理後移到新的培養基上，否則殘餘的培養基將影響植株的狀態。

其次，有哪些培養條件可以進行人為的改變呢？

光照的強度、光質與光照時間；
培養基的無機成分、有機成分，尤其是生長調節劑；
培養基的PH值；
培養基的一些添加劑；
培養的溫度、濕度、培養瓶通氣性等；

下面，我們對這些條件進行逐條的解析：

光照對植物組織的影響：

當發生以下問題時，需要考慮光照因素：

誘導營養生長與生殖生長——光質、光周期，遠紅光通常可誘導生殖生長；

組織褐變率高——光強過強、光照時間過長；

葉片黃化或生長速度慢——光照不足；

培養基成分的影響：

植物組織培養的培養基通常需要考慮添加以下成分：

無機鹽成分——其中，氨態氮、硝態氮的比例和組織的脫分化與再分化有關，Fe、Mg與葉綠素生成有關、Ca與愈傷組織生長有關，還有很多針對不同植物特殊需求而添加的元素，等等；
瓊脂等固相支持物——與培養基的凝固能力有關，通常添加0.8 % - 1.2 %的瓊脂即可滿足實驗需要；
蔗糖、葡萄糖等碳源——與組織的生長速度有關，通常不會影響組織的形態，一般添加0.5 % - 4 %，通常2 % 的蔗糖可供組織吸收一個月；
維生素、煙酸、肌醇等其他有機成分——可促進胚狀體的形成，協助組織進行各項代謝；
培養基PH的影響：

培養基PH不適宜可能導致組織褐變和玻璃化，但不同植物對PH的敏感性不同，如苔蘚植物對培養基PH的敏感性較低，而一些單子葉植物則對培養基PH十分敏感。

活性炭、椰奶等添加劑：

活性炭可吸收受傷的植物組織產生的酚類，同時保護易降解的植物激素，在容易發生褐變與玻璃化的組織培養馴化過程中，可以嘗試在培養基中加入活性炭，一般1 g/L。

椰奶、洋蔥、土豆泥、香蕉泥、胡蘿蔔汁等添加成分，其化學成分不完全清楚，但往往具有著一定的調節作用，諸如香蕉泥可以穩定PH有利於壯苗、土豆泥可以補充維生素有利於生根等。

培養室的一些環境參數：

培養室的環境尤其溫度會對植物培養造成一定的影響，一般植物組織培養可使用23 – 27 ℃的溫度區間。在一定範圍內，濕度、通氣性等條件通常不會對組織造成關鍵性的影響。

特別地，植物生長調節劑在組織培養中的關鍵作用：

植物生長調節劑可分為生長素類、細胞分裂素類、赤霉素、特殊調節劑類四種。

生長素類通常可以誘導植物組織生根、生芽，與細胞分裂素類搭配可以使高等植物向生芽、生根和保持愈傷組織狀態生長，而低等的苔蘚植物沒有根莖葉的明顯分化，其形態建成較為複雜。通常，IBA與NAA、IAA造成的效果相似但相對更強，2，4-D造成的效果與另外三種生長素有著顯著不同。細胞分裂素可顯著提高愈傷組織的生長速度，但對低等植物效果不明顯。

特殊調節劑，如酚噻隆、PSK等，具有著強烈的調節效果但機理尚不明確，可在培養基中嘗試添加。

植物生長調節劑是最重要的組織形態建成的方式，在植物組織培養中添加不同的激素不僅可以改變植物生長的特性，還可能改變植物的次生代謝特徵，因此研究激素對某種或某類植物的影響是一項有意義的科研問題。

以上，就是植物組織培養的兩個核心步驟，希望能夠幫助到各位~