分析方法驗證做法與可接受標準

05-11

在藥品研發中，為了保證藥品的質量，我們制定藥品標準，藥品標準里的分析方法都必須經過驗證，確保方法能持續的、穩定的、準確的檢測產品的質量。

分析方法中最常見的方法之一色譜法，一般用於含量、有關物質及殘留溶劑的檢測。

下文就根據個人多年分析經驗對含量和有關的方法驗證做法與可接受標準進行闡述，同時也參考了2015年版中國藥典、ICH-Q2A/B、USP1225、2010年版GMP對分析方法驗證的要求與做法。

1 專屬性

1．1干擾性和選擇性

該實驗主要目的就是證明被檢測物能夠與雜質峰分離，因此建議各個單獨化合物應該適當地在色譜圖中標記色譜峰。具體做法如下：

取稀釋劑作為空白溶劑
取處方比例的空白輔料配製成同濃度的空白輔料溶液（此條適用於製劑）
各個單個雜質定位溶液
一定濃度的原料葯（製劑）溶液
往原料葯（製劑）溶液中加入各個雜質（限度濃度）製成系統適用性溶液

接受標準：空白溶劑和空白輔料對主成分的測定無干擾（含量）；空白溶劑和空白輔料對主成分和雜質的測定無干擾（有關物質）；最近雜質與主成分的分離度達到2.0；雜質之間的分離度大於1.5（有關物質）。

1.2 強制降解試驗

在無法獲得所有雜質的時候，應該進行此試驗，現在的情形是，所有製劑或原料研究時都會進行此試驗，因為基本無法獲得全部的未知雜質。

取未破壞的原料（製劑）溶液
取未破壞的空白輔料溶液（製劑）
酸、鹼、高溫、光照、氧化破壞的原料（製劑溶液），其中高溫、光照可分為固體和液體進行破壞
酸、鹼、高溫、光照、氧化破壞的空白輔料溶液，其中高溫、光照可分為固體和液體進行破壞（製劑）
酸空白、鹼空白、氧化空白溶液

接受標準：排除特殊情況，如果可以的話至少一個條件破壞在5%~10%之間（以峰面積百分比計），關注雜質增長個數與分離度，新出現雜質是否干擾主成分測定，必要時關注峰純度,計算時一般計算物料平衡在95%~105%，計算公式為： (該破壞條件下扣除溶劑峰和輔料峰後的峰面積之和/該破壞條件下樣品濃度)?(未破壞條件下扣除溶劑峰和輔料峰後峰面積之和/未破壞條件的樣品濃度)

注意：破壞程度不強求，如果在主成分很劇烈條件下依舊很穩定，也不必強行破壞。如果出現新的雜質，建議採用液質聯用進行分析。

2 準確度

準確度系指採用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（％)表示。準確度應在規定的範圍內測定。

3 線性和範圍

線性系指在設計的範圍內，測定響應值與試樣中被測物濃度呈比例關係的程度。線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量測定和含量測定均需驗證線性。

3.1 配製方法：

含量（原料和在製劑相同）：

用同一份主成分的對照品儲備液稀釋，從LOQ開始到120%（範圍應覆蓋所有待測濃度，不可超出線性方程外推得濃度，如果有測含量均勻度的，建議把範圍擴大到150%）之間稀釋至少5個點（一般會做到6個點，點之間範圍要比較均勻，如LOQ、30%、50%、70%、90%、100%、120%）

以濃度為橫坐標，響應的峰面積（必要時，信號可經過數學轉換再用小二乘法進行回歸計算）為縱坐標做線性曲線回歸。記錄線性方程，統計R值和截距。

有關物質：（原料和在製劑相同）

可以根據雜質限度比例配製一份混合雜質母液，將母液稀釋從LOQ~150%或200%（範圍應覆蓋所有待測濃度，不可超出線性方程外推得濃度）之間取至少5個點，例如LOQ、30%、50%、70%、90%、100%、120%、150%進行測定。

備註：LOQ水平建議連續進6針，考察LOQ，100%水平連續進6針考察進樣精密度。此外，2010年版GMP指南中要求每個濃度的線性溶液進3針。

3.2可接受標準：

含量：R值≥0.998，Y軸的截距（絕對值）在限度100%時響應值的2%以內

有關物質：R值≥0.990，Y軸的截距（絕對值）在限度100%時響應值的25%以內。

注意：如果要計算校正因子（計算方法為：主成分的斜率/雜質斜率）時，計算校正因子時線性應由不同人員在不同時間不同儀器上進行（每次重新配製），至少要測定3次，得出的校正因子偏差應在±10%以內。同時如果校正因子小於0.2或者大於5不可採用校正因子法計算雜質含量。

4 精密度

精密度體現了多次重複測定同一被分析物時各測定值之間的接近程度，但它不能表達與已建立的真實值或參考值之間的符合程度，後者由準確度來測定。通過一系列的測定值，可以得到良好的精密度。

重複性：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重複性。

4.1 重複性

含量：配製6份供試品溶液，採用外標法進行測定主成分含量。

接受標準：含量：主成分含量在標準範圍內，且6份的含量的RSD≤2.0%（製劑）；RSD≤1.0%（原料）。也可按照準確度方法採用 3個濃度，每個濃度3份進行配製和計算

有關物質：往6份供試品溶液中加入100%濃度水平的各雜質，採用自身對照法或者校正因子法或者外標法測定雜質含量，計算時建議統計已知單雜、未知單雜，總雜。

接受標準：根據雜質限度不同，接受標準有所不同，具體如下：

限度<0. 05%或LOQ；RSD≤ 20%

0.05≤限度< 0.2%；RSD≤15%

限度 >0.2%；RSD≤10%

4.2中間精密度：

考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響。

做法同重複性

接受標準：含量：主成分含量在標準範圍內，且6份的含量的RSD≤2.0%。

也可按照準確度方法採用 3個濃度，每個濃度3份進行配製和計算。

有關物質：接受標準同重複性。

5 檢測限

做法：取相應的對照品溶液進行稀釋，稀釋至信噪比不低於3。

6 定量限：

取相應的對照品溶液進行稀釋，稀釋至信噪比不低於10.連續進6針，統計出峰時間和峰面積，要求出峰時間RSD≤2.0%，峰面積RSD≤5.0%

7 穩定性：

含量：配製對照品溶液、樣品溶液、系統適用性溶液考察。

有關物質：配製對照溶液，分離度溶液，加入限度雜質的樣品溶液。

常溫穩定性：

含量：每隔數小時進樣，記錄主峰峰面積（對照品溶液和樣品溶液），系統溶液中還應統計分離度。

有關物質：每隔數小時進樣，統計對照溶液中主峰的峰面積；樣品溶液中主峰、各雜質峰的峰面積；分離度溶液中記錄分離度和各峰峰面積

特定溫度穩定性：

在此條件下可以隔數天進樣，對照品含量需要用新的對照品外標法進行計算。分離度溶液應記錄分離度和各峰峰面積。

接受標準：

含量：與0小時主峰峰面積相比，比值在0.98~1.02之間，且峰面積RSD≤2.0%；如果是相隔數天的對照品溶液的穩定性，每次測定含量應在98.0%~102.0%之間；系統適用性溶液中與主峰最近的峰分離度應大於1.5，且不出現新的雜質峰。

有關物質：對照溶液及各雜質峰面積與0小時峰面積相比，比值在0.90~1.10，且RSD≤2.0%，主成分與0小時主峰峰面積相比（主成分不過載），比值在0.98~1.02之間，且峰面積RSD≤2.0%；相隔數天的分離度溶液中，各雜質峰分離度均符合規定，且不出現新的雜質峰。

8 耐用性：

耐用性包括提取方式，提取時間，濾膜吸附性等和色譜條件耐用性（波長、柱溫、流速、流動相的比例和pH，色譜柱）

其中提取方式（片劑）可以採用直接投片法或者研磨法，測定上述方法的含量，提取時間為將樣品超聲不同的時間，測定其含量。

濾膜吸附性可分別濾去不同的體積，同時製備一份不過濾採用離心方式的樣品，測定含量

色譜條件變化一般為柱溫變化±5℃，流速變化±10%，波長變化±5nm，pH值變化±0.2，流動相比例變化5%。

接受標準：不同提取方式、提取時間，濾膜吸附性中，含量應在98.0%~102.0%之間。色譜條件變化時，滿足系統適用性的要求，體現為主峰和最近雜質分離度大於1.5，各雜質峰之間達到基線分離，拖尾因子大於2.0。