【工具】Mutagenesis

05-10

Mutagenesis對基因的編輯包括替換，插入，和刪除。這裡用的是NEB的Q5 Mutagenesis kit.

關於基因的插入

用這個方法插入一小段基因的本質就是，在primer上加入一段你要的基因，然後跟上互補的二十幾個bp，這樣PCR的時候，你的基因就會跟著一塊複製了。

根據NEB官網的說法，插入的基因大小理論上沒有限制，但實際的限制包括primer合成的最大長度，以及過長的primer是否會產生secondary structure而影響PCR。

而sigma的正常primer合成長度最大是160bp，兩段primer的長度加起來就有320bp，減去PCR互補的地方（大約25bp,兩個就是50bp），那麼能插入的基因長度最大就是270bp。某些程度上，如果你想插入一段promoter，這個長度是足夠了。

首先設計primer。

可以利用NEB官網的工具，如下圖：

拿到primer之後，進行PCR, 如下：

上圖是25ul體系，你也可以按比例做成10ul體系，這樣可以節省一些試劑。

混合好之後，按照下圖的溫度進行PCR。

星號的地方是你primer的Tm溫度，這個溫度是之前官網跟著primer序列一起給你的。然而，根據我個人的經驗，這個溫度由時候往往並不work（批不出東西來），所以我往往會在官網給出的溫度下再低5度，再運行。

Optional

想知道你是否得到PCR產物的最好辦法就是跑一個膠，如果有band並且size正確，則可進行下一步。

得到PCR產物之後，接下來要將PCR的兩端粘合，從而形成一個環。

這裡利用的是一個叫KLD的酶，步驟如下：

室溫下5分鐘或者更長就足夠。

之後5ul轉進入E.coli，第二天挑克隆便完成了。最後測序。