實驗方法：組織蛋白提取及濃度測定

05-10

一．組織蛋白提取

1.組織稱重勻漿

（1）每個EP管放入做多100mg組織，按照100mg/1ml

加入裂解液

（2）裂解液配方（50ul：40ulRIPA＋5ul蛋白酶抑製劑＋5ul磷酸酶抑製劑＋0.5ulPMSF）

（3）2個50ml燒杯，一個放生理鹽水用於清洗勻漿器頭；另一個放冰用於放盛有組織的EP管。每次勻漿2s（或者5-8s）

2.裂解

（1）4℃裂解30min

（2）離心機預冷（15000轉 4℃ 10-15min）

（3）取上清（約可獲得800ul）

如果改天測蛋白濃度，將提取好的上清儲存於-80℃。

二．蛋白濃度測定

1.配製蛋白標準品（5mg/ml→0.5mg/ml工作液）（蛋白標準品可分裝保存1ML）

用RIPA（或PBS）稀釋標準品（如下）

標準品：取10ul稀釋至100ul（每份，通常用兩份）

2.配置BCA工作液

BCA試劑盒A液：B液=50：1

每孔需加工作液200ul，由此計算總體積

3.蛋白濃度檢測上樣（上樣前吹打混勻樣品）

每孔加入4ul（2ul時為10倍稀釋）蛋白樣品，每孔用16ulRIPA（或PBS）補充至20ul（5倍稀釋蛋白樣品，防止蛋白濃度過高，超過監測上限，因此最後得到的蛋白濃度應×5），再加入200ul工作液。

4.37℃孵育30min（可適度延長）

5.上機監測蛋白濃度

（1）打開電腦，酶標儀以及Gen5軟體

（2）放入96孔板(A1對A1)

（3）新建→檢測→輸入檢測波長（根據不同試劑盒波長不同，碧雲天為562nm）→確定

（4）板布局中選標準曲線和樣本，複本3個（也可選擇複本1個，由檢測重複次數決定）

（5）輸入標準品濃度（如上所示）→下一步

（6）樣品三個複本→確定

（7）選定空位對應實際孔位

（8）單擊開始測定 按鈕開始

（9）保存並導出xls文件

（10）選數據處理→標準曲線→確定

（11）選數據處理→圖形

（12）將公式導出至xls文件

（13）自行計算出上樣蛋白濃度

6.計算上樣20ug所需蛋白樣品體積與上樣緩衝液體積（上樣緩衝液為5×，可稀釋＞至1×使用，升溫至體溫更利於取用，其取用體積通常為蛋白樣品體積的1/4）。

7.煮蛋白（蛋白通常現用現煮）

使用PCR儀煮蛋白，詳見視頻。煮好的蛋白立刻放入-80℃冰箱保存。

蛋白+上樣緩衝液（緩衝液＞1×使用），95-100℃煮5-10min。

冰上立刻降溫5min。

轉自一位實驗大神的筆記。