【工具】shRNA的設計

想要研究一個基因，肯定需要把這個基因knock down或者knock out掉。

如果要knock down，最常用的就是shRNA。

想必現在很多同學一說到做knock down實驗，就會直接去訂一些現成的shRNA。

好處是快，省事。

然而訂久了現成的東西，我們往往忽略了它們是如何設計的。

所以今天，我們就來聊一聊shRNA的設計，以sigma家的為例子。

下圖是一個他們家的shRNA的載體，pLKO.1。

大部分shRNA都由U6驅動。和驅動蛋白合成的PoII promoter不同，U6是Pol III promoter，意味著它主要驅動RNA而非蛋白。

如果想要自己連入一段shRNA的話，需要設計兩段互補的Oligo，形成雙鏈，並連入上面的載體中。

Sigma設計Oligo的公式入下圖：

• Top chain: 由CCGG引導，一段21bp的序列，之後為CTCGAG的loop，一段21bp的反序列，接下來是Tx5+G (TTTTG)
• Bottom chain: 和top保持互補，5』開頭為AATTCAAAAA

將設計好的Oligo進行annealing，形成雙鏈。同時將載體pLKO.1進行EcoRI和AgeI的digestion。ligation連入載體。

大功告成，這樣一段由U6驅動的shRNA就製作好了。

接下來只需要將其和psPAX2以及pMD2.G同時瞬轉入293T細胞，合成病毒，transduce你的目標細胞就能完成一組敲除了。

shRNA的設計是不是很簡單呢？科科。

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