生物信息學100個基礎問題 —— 第23題 轉錄組的比對與基因組的比對有何不同？

Hello大家好！我們今天又見面了！

我們通過前期的22個問題，從數據的簡單質控，到測序數據的mapping，再到mapping後的SAM文件都有了一個比較清楚的認識。那麼說了半天的mapping問題，一直都是在以DNA進行舉例，RNA的比對我們都還沒有談。那麼今天我們就來簡單談談RNA序列的mapping，尤其是真核生物的RNA序列比對。

1. RNA與DNA結構的不同

一般來說，DNA的mapping比較容易，因為DNA在基因上是連續的，直接回貼到基因組就可以找到相應的定位。就比如我們常用的Whole Genome Sequence（WGS）即全基因組測序；或者是我們所說的ChIP-Seq即染色體免疫共沉澱測序都是直接對DNA進行建庫測序，其測序結果都是FASTQ文件，直接用bowtie2，bwa比對到基因組就可以拿到標準的SAM文件。

但是RNA就不一樣了，真核生物的RNA需要經過複雜的加工過程。在細胞中RNA層面的調控至少可以分成2個大的階段co-transcription（轉錄的同時） 和 post-transcription（轉錄以後）其中的調控機制也有很多。

對我們mapping影響最大的因素是：真核生物轉錄出來的初步的mRNA都是帶有intron（內含子）的，隨後都需要在co-transcription（轉錄的同時） 或post-transcription（轉錄以後）階段通過：1. alternative splicing（可變剪切）剪切掉intron；2.polyA尾巴； 3.加5的帽子結構。這3個步驟，將不成熟的mRNA變為最終成熟的mRNA再轉運出核，行使功能。

而我們在進行RNA-Seq建庫的時候，一般情況下都是使用oligo dT針對帶polyA尾巴的成熟mRNA進行富集，然後再進行反轉錄獲得cDNA，之後再使用cDNA進行建庫測序。所以，我們最終得到的測序結果是與成熟mRNA序列保持一致的，只包含了exon的序列。而exon在基因中間是有intron分割的，因此在回貼回基因組的時候，回遇到跨越intron的reads回貼。所以這個問題不能使用原來針對DNA的mapping策略進行mapping。

2. RNA比對的常用軟體

目前大家最常用的轉錄組比對軟體有下面幾個：

1. tophat2，應用最廣泛的比對軟體，但是速度很慢，已經基本被淘汰了，大約需要4~5G內存就能運行；
2. hisat2，tophat2的原班人馬搞得新一代轉錄組比對軟體，比對速度大大提高，我強烈推薦，大約需要4~5G內存就能運行；
3. STAR，非常適合於大量數據的並行計算，速度非常快，對於同時有參考基因組和參考轉錄組的物種，比對的準確率很高，不過index很大，至少需要30G以上內存才能運行。

3. 提出問題

問題1：如果你有一套標準的polyA捕獲得到的RNA-Seq測序數據，對reads進行了前處理工作與質量控制工作，但是你的比對策略為：先嘗試mapping，把能mapping到基因組上的reads都先mapping；然後把不能進行mapping的reads進行一定規則的拆分，再進行第二輪mapping，從而解決跨intron區域的問題（以上為tophat的mapping策略）。請問，這樣mapping的最大問題是什麼？（提示，需要知道一些假基因的概念！）

問題2：在human中，是不是所有的蛋白基因（protein coding gene）都含有intron？

問題3：在human中，是不是所有的蛋白基因的成熟mRNA都有polyA尾巴？

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