【工具】Cytotoxicity Assay（細胞毒性測試）

Cytotoxicity Assay的方法有很多，今天給大家介紹的是通過測量LDH濃度的方法進行的assay，用的kit是來自於Promega的CytoTox 96 Non-radioactive。

LDH的測量機理如上圖：

• 細胞死亡的時候LDH（一種酶）會漏出來，使得NAD+變成NADH。
• 而NADH剛好是INT轉換到Formazan的必需品。
• formazan有特定的波長，使得LDH的濃度可以測量。

測試目的是看看Effector細胞是否能有效殺死target細胞。

incubate的比例是Effector : target = 20:1, 也可以更大或者更小。

96孔板做的話大概就是，effector=6e5, target=3e4

（記得鋪細胞的時候duplicate/triplicate）

兩種細胞不僅要鋪在一起，還要勻出單獨的well出來，單獨鋪effector，或者target，這樣做的目的是可以單獨看看這些細胞有沒有什麼凋亡。

對於單獨細胞的測量，我們稱effector的測量為effector spontaneous；另一個叫target spontaneous。

同時，我們還需要一個positive control，就是把單獨的target細胞用lysis bufer給溶解了，之後的測量，稱為target maximum。

LDH的半衰期是8個小時，所以我們讓effector和target incubate大概8-9個小時。

總結下來所需要的well就是：

• effector 單獨 - effector spontaneous
• target 單獨 - target spontaneous
• effector/target 混合（8-9h） - tested sample
• target + lysis buffer - target maximum

之後按照kit說明書進行LDH測量。

kit會提供：

• CytoTox96 Reagent：
• 由12ml Assay buffer + 1 vial Substrate Mix 混合在一起 （-20C store to 6wks）
• Assay buffer has precipitates, 300g, 5min, use sup.
• 12ml is enough for 200 times, 50ul/time
• LDH positive control （4C）
• lysis buffer (4C)
• stop solution (4C)

注意，全程都要確保CytoTox96 Reagent不要和光接觸。

實驗步驟：

1. add 6e5 effector and 3e4 target (total is 100ul) in to 96well
1. single target （target spontaneous）
2. single effector （effector spontaneous）
3. mix （experimental）
4. single target + lysis buffer (target max)
5. empty 100ul + lysis buffer (control for target max )
6. empty 100ul (control for first 3)
7. 2ul LDH positive control + 1ml 1%BSA PBS (100ul positive control)
2. to make sure target and effector contact, centrifuge 250g, 4min
3. 37C, 8-9h
4. 45min before LDH measurement, add 10ul 10x lysis buffer into "target max"
5. before collecting sup, 250g, 4min
6. 50ul sup. to new flat 96 well plate
7. add 50ul CytoTox96 Reagent, cover with foil
8. RT, 30min
9. add 50ul STOP
10. pop bubbles by syringe
11. measure at 490/492nm

下面是一個96孔板的排版，其中我的sample well都進行了triplicate.

你可以參照我的，也可以自己設計。

計算：

1. 將步驟1中，進行4減5
2. 步驟1中，進行1，2，3分別減去6
3. 用步驟1中的數，帶入下面的方程：

最後就能得到% Cytotoxicity了。

步驟總結下來，就是下圖：

(50ul sup + 50ul reagent, 30min later, 50ul stop, 490nm)

PS:建議medium全部用T cell culture的medium。因為T cell 有些脆弱，在其他的medium里可能apoptosis的比較多。