實驗方法：Western Blot

一．制膠

1.安裝制膠裝置

玻璃板及制膠裝置用前清洗乾淨，晾乾。

保證兩塊玻璃板下緣水平且均無豁口，安裝玻璃板（內長外短），用手壓實玻璃板及垂直槽制膠架。

傾斜垂直槽制膠架子裝入垂直槽制膠固定架（為防止膠片變形漏液體，不要過分用力下壓），卡好。

2.配製分離膠

註：加完TEMED後立即混勻鋪板；加入＞3/4玻璃板高度的分離膠，可適當高，以防漏液。

3.鋪板，水封（ddH2O），鋪滿（最好用無水乙醇封）。

4.膠凝後（可以觀察到明顯的分界線或剩餘分離膠已凝），倒掉無水乙醇，用ddH2O輕輕沖洗，可直立膠板倒掉多餘的水。

5.配製濃縮膠（2板約3ml）

6.上膠並插梳子（水平迅速，不能有氣泡），先棄無水乙醇，再水洗後棄水。

7.濃縮膠凝固後從制膠架上拆下，沖洗乾淨漏出膠體，完全浸入ddH2O 4℃冰箱過夜。（膠可現做現用，但是放置時間越長，跑電泳效果越好）

二．配液

配製電泳液，轉膜液，TPST及5％脫脂奶粉（跑電泳前一天完成配膠及實驗相關液體配製）

三．跑電泳

1.安裝電泳槽，注意使用主板（有兩個個金屬電極），玻璃板（檢查玻璃板是否乾淨）安裝梳子對梳子，不要將梳子壓在膠片上（否則影響拔梳子）。

2.放入冰袋，倒入電泳液（先倒電泳槽中間，由中間流向四周，中間電泳液必須使用新液）。

3.取出蛋白樣品，上樣前離心。

4.拔梳子（水平緩慢拔起），用槍頭吸吹（電泳液，槍頭不要插入兩個玻璃板之間，貼長板吹，緩慢溫柔）各槽去除多餘膠。

5.上樣，先上marker，兩側上marker，每孔6ul。加樣時注意正反，不要加入氣泡。

每孔最多加30ul（通常上樣量為40ug 20ug，如需加30ul，需要先加15ul沉澱一下，再加15ul）。

6.裝電泳槽蓋（紅對紅，黑對黑），80V，到達分離膠時120V，60V恆壓（注意是否有電流，通常電流為20多mA，功率為1-2W）將樣品壓入分離膠（通常起始分離膠與樣品距離0.5cm為最佳）。

7.調整電壓至100V，繼續電泳至完成。

四．轉膜

1.切膠並轉移至電轉液中。

2.按如下順序安裝轉膜槽樣品夾板

黑板（最下方）→海綿墊→濾紙→膠→PVDF膜（甲醇提前浸泡激活，30s）→濾紙→海綿墊→白板→上扣（逐層用滾輪壓實）

3.電轉槽安裝（放入冰中，冰袋至於槽中，夾板與轉膜槽黑對黑，紅對紅），加入電轉液，液面超過PVDF膜。恆流

電轉條件：

4.電轉完畢後，剪膜，注意正反面。

五．免疫反應部分

1. TPST（1×）清洗5-10min

2. 5％脫脂牛奶封閉（脫脂奶粉提前配好，防治封閉不均勻），室溫2小時（搖床）或4℃過夜。

磷酸化蛋白用5％BSA封閉

3. TPST（1×）洗膜3次，每次10min

4. 一抗4℃封閉過夜（最佳）or 室溫搖床2h。GAPDH工作濃度（1：5000）

一抗用5％脫脂牛奶配製（磷酸化蛋白用5％BSA配製）

5. 過夜後一抗搖0.5小時（一抗回收儲存於-20℃），TPST（1×）洗膜3次，每次10min

6. 二抗室溫搖床封閉2h（5％脫脂牛奶配製）。工作濃度（1:5000）

7. TPST（1×）洗膜3次，每次10min（打開ECL顯色儀預冷，更換好CL板，打開軟體）

8.PVDF晾乾備用

9.配製ECL顯色液（A液：B液為1：1；避光，一張膜500ul），配完後30min內使用。

六．ECL發光（詳見視頻）

備註： 因為GAPDH 作為管家基因在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恆定的，因此在使用GAPDH內參抗體時，將每個樣品測得的目的蛋白含量與本樣品的GAPDH含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量，然後才進行樣品與樣品之間的比較。

轉自一位實驗大神的筆記。