科研工具 | 分子對接-生物醫學科研之畫龍點睛

今天SinoScript小編就帶領大家了解我們新推出的分子對接技術服務，一項讓研究增彩加分的實用技能！

眾所周知，蛋白結構和功能是密切相關的。目前上市的藥物，包括小分子藥物、多肽藥物、大分子蛋白藥物都是通過與藥物靶標蛋白結合，影響靶標蛋白結構和信號通路發揮藥理藥效。近年來，結構生物學（Structural Biology）的飛速發展，使得靶標—藥物的關係清晰地被闡明，它的主要目的是獲得構成活體細胞的各種生物大分子組件的高解析度三維結構信息，闡明生物大分子的作用機制和原理。但由於其實驗條件苛刻，技術要求高尤其是學科差異化的緣故，多數科研單位沒有相關平台。因此，限制了大部分科研單位深入研究靶標和藥物之間的相互作用關係，影響了後續科研的進程，而分子對接技術的出現有望為普通科研單位提供一條「捷徑」。

分子對接就是兩個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別的過程，即可通過分子對接確定靶標和配體正確的結合模式和結合強度。

結構生物學的快速發展為分子對接技術奠定了基礎。如今，分子對接技術已成為藥物設計、藥理學、分子生物學等領域中極為重要的輔助工具。簡單來說，在通過調研已知一個靶點的三維結構之後，如何預測一個小分子或多肽是不是有潛在的藥效？或者已經通過藥理及分子生物學實驗初步得知藥物（某小分子或多肽）的療效及靶點後，如何進一步明確靶點的準確性或者形象的解釋呢？對於小編這樣的藥物設計工作者來說已非難事。用行話講，就是先docking一下，即分子對接預測一下；然後再計算一下結合自由能，即計算氫鍵相互作用、范德華相互作用、靜電相互作用等。能夠形象且科學地揭示作用機制，闡明靶點-配體相互作用關鍵位置和關鍵氨基酸殘基，不僅提高了研究的深度，而且使數據更加形象化美觀化，投稿也更受審稿人青睞，且看下文案例分解！

案例介紹：某化合物靶向5-LOX作用機制研究

背景

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)是含有非血紅素鐵離子的雙加氧酶，廣泛存在於需氧生物中。LOX可分為1-LOX、3-LOX、5-LOX、8-LOX、12-LOX以及15-LOX等，而5-LOX是其中最重要的一種，當炎症因子刺激機體時，被激活的胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)促使膜磷脂釋放花生四烯酸（AA），此時前體化合物AA會經過5-LOX途徑最終產生白三烯類(LTs，屬於重要的炎症介質，參與了許多疾病如動脈粥樣硬化、心血管疾病、心臟病等病理生理過程)。在AA被5-LOX轉化過程中，5-LOX激動蛋白（FLAP）起到了至關重要的作用，它可結合底物AA，並將其轉移給5-LOX，決定了LTs的產生與否。

綜上所述，干擾LTS的合成可通過抑制cPLA2, 5-LOX或是競爭結合FLAP這3種方式。據文獻報導，1,4-苯醌類化合物是著名的5-LOX抑製劑，但其抑制5-LOX的分子機制始終未被探究清楚，於是作者就以RF-Id（1,4-苯醌類化合物的衍生物，圖1）為例，來探究1,4-苯醌類化合物的作用機制。

研究思路

首先，作者利用生物實驗研究RF-Id是通過抑制cPLA2, 5-LOX還是競爭結合FLAP來發揮作用。在確認RF-Id與cPLA2，FLAP的關聯不大後，作者便繼續研究其抑制5-LOX的作用機制。

5-LOX抑製劑可被分為4類：1還原型抑製劑，可干擾活性位點鐵離子的還原2可螯合鐵離子的抑製劑3競爭型抑製劑，與AA/脂肪酸氫過氧化物相競爭4新型抑製劑，具獨特的作用機制。

顯然，RF-Id不能與鐵離子螯合，故可排除2；那麼它可能是還原型抑製劑嗎？若為還原型抑製劑，它對同為非血紅素鐵雙加氧酶家族的12-LOX，15-LOX應該也有較強的活性。於是，作者又對此進行了研究，發現RF-Id對12-LOX，15-LOX沒有抑制作用，所以RF-Id也不是還原型抑製劑。那麼，它到底是競爭型抑製劑還是有獨特的作用機制呢？

通過相關生物實驗數據和分子對接，研究者終於發現了其中奧妙。那麼，讓小編帶領大家了解下部分研究細節吧[1]！

生物實驗

從圖2左圖可知，RF-Id對5-LOX的生物活性較高，且外源性AA的濃度對RF-Id活性影響不大，說明RF-Id並非通過抑制cPLA2或是競爭結合FLAP來發揮作用。

從圖2右圖可知，RF-Id僅對5-LOX有較好的抑制作用，對12-LOX及15-LOX並無明顯作用，所以其並非還原型抑製劑。

在得到了實驗方面數據之後，問題來了，RF-Id到底是怎麼發揮作用的呢？且看分子對接助力實驗結果，為科研畫龍點睛！

分子對接

基於5-LOX的晶體結構，研究者利用分子對接技術進一步驗證了之前的判斷。如圖3所示，RF-Id的疏水環（橙黃色部分）充滿了鐵離子運動的疏水通道（AA被氧化之處），其羥基化的苯醌結構則分別與Gln557, Tyr181, His367及H2O855形成了氫鍵，進一步穩定了RF-Id與5-LOX的結合，與之前的實驗結果相吻合。打個簡單的比喻，5-LOX好比一把鎖，花生四烯酸是鑰匙，進入鎖內轉動才能發揮作用，現在RF-Id就像502膠水，牢牢堵住了5-LOX的鎖洞，導致AA無法發揮作用。

總結

結合實驗和分子對接，研究者發現RF-Id對5-LOX具有良好的活性，且其並非通過抑制cPLA2、競爭結合FLAP、干擾鐵離子還原、螯合鐵離子來實現，而可能是通過插入5-LOX的活性位點中的疏水通道（為競爭型抑製劑），並與幾個關鍵氨基酸形成重要氫鍵來起到抑制作用。分子對接在本研究中形象揭示了這一作用機理，為該研究做了一個畫龍點睛。

參考文獻

1.Schaible, A.M., et al., Elucidation of the molecular mechanism andthe efficacy in vivo of a novel 1,4-benzoquinone that inhibits 5-lipoxygenase.Br J Pharmacol, 2014. 171(9): p.2399-412.

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