ROS1融合突變和靶向藥物

ROS1基因也是肺癌中經常被提及的基因突變，但是其突變頻率並不是特別高。另外很多患者和家屬沒有分清楚ROS1的突變形式，很多不靠譜的基因測序公司，對於ROS1基因上一個位點的突變都解析是藥物敏感突變，對患者的靶向用藥產生了極大的干擾。本帖注重對ROS1的基因突變形式、對應的靶向藥物做一次系統梳理。

1、認識ROS1基因和其突變

ROS1基因的重排最開始是在人腦膠質瘤細胞系裡被鑒定出來，後續在其他幾個惡性腫瘤里也發現了ROS1基因的重排，如膽管癌、卵巢癌、胃癌和非小細胞肺癌，其中在非小細胞肺癌里的突變頻率為1%-2%。ROS1基因可與多個基因發生融合突變，其中最主要的融合伴侶是CD74，（見下面圖片），ROS1與其他基因發生融合時，一般會保留激酶結構域，而且在斷裂點上較為保守。ROS1的重排導致激酶持續激活，上調SHP-1、SHP2以及PI3K、AKT、mTOR、MAPK和ERK信號通路，導致細胞持續增殖，腫瘤發生。

圖1：非小細胞肺癌中ROS1基因的融合形式

上圖是ROS1基因的融合形式，左側的綠色部分為ROS1的酪氨酸激酶結構域，藍色部分為跨膜結構域。右側部分是報道的與ROS1發生融合變異的基因和其頻率。由於存在多種基因可能與ROS1基因發生融合，因此在選擇檢測ROS1的變異時，需要著重技術原理，避免漏檢。檢測ROS1突變的技術有FISH（原位免疫熒光雜交）、RT-PCR（逆轉錄PCR）、IHC（免疫組化）和新一代測序（NGS）。目前FISH是ROS1融合的金標準，通過紅色和綠色熒光探針標記ROS1基因兩端，如果ROS1基因沒有發生斷裂，那麼紅綠熒光湊在一起表現為黃色熒光信號。如果ROS1基因中間發生了斷裂，則可以觀察到紅色熒光、綠色熒光信號的分離，如果大於15%的腫瘤細胞呈現出這種分離信號，則判斷為ROS1基因融合突變陽性。

圖2：FISH檢測ROS1基因的重排

需要認識到任何檢測技術都不是完美的，FISH的優勢是可以檢測石蠟切片組織（FFPE），這是RT-PCR不能具備的，RT-PCR對樣本的RNA要求較高，需要新鮮的組織樣本提取RNA才能進行逆轉錄。另外FISH還可以檢測一些未知的融合突變，即不需要知道ROS1基因的融合伴侶是誰，只要ROS1發生分離了就行。缺點是手續繁瑣、對試驗員的操作要求較高。另外FIG基因在ROS1上游134kb處，因此FIG-ROS1的融合形式在熒光信號分離上不是很好判斷。最關鍵的是FISH不能提供出和ROS1發生融合的伴侶基因是什麼，是否有生物學和臨床的意義。

RT-PCR因為需要之前設計引物，所以不能檢測未知的融合突變形式。對樣本的RNA要求較高，石蠟標本里RNA降解很嚴重。因此如果您的檢測報告表明是RT-PCR檢測的融合突變，而您的標本是石蠟標本，那麼就需要注意是否存在假陰性的情況，不管是ALK或者ROS1以及RET都是這種情況。RT-PCR的優勢是快速、樣本需求量少。

ROS1的免疫組化檢測特點是簡單，易操作。但是對抗體的要求較高，另外易受到染色背景、判讀標準的影響，也有很多地方亟待提升。總之對於ROS1基因的融合突變，最好使用兩種以上的檢測技術進行相互驗證，沒有一項技術是可以做到100%的承諾的保證的，但是對於患者來說，漏檢因為所有的希望。

2、ROS1的患者和病理特點

ROS1融合突變是非小細胞肺癌的一個亞型（突變頻率1%-2%），ROS1的患者群與ALK突變的患者擁有一些共同的特徵，患者的特點是年輕、非吸煙、亞裔、進展較快。儘管ROS1融合突變也在肺大細胞癌、鱗狀細胞癌里被鑒定出來過，但是ROS1主要是存在於肺腺癌中。

ROS1基因與其他驅動基因突變是不共存的，一項涵蓋1073個樣本的研究表明ROS1與EGFR、ALK等突變互斥，沒有發現他們共同存在。一項涵蓋556個患者的研究也表明，使用免疫組化IHC檢測ALK和ROS1，沒有發現二者共存。後續有報道研究兩名ROS1陽性的患者發現了EGFR突變，分別是L858R和19號外顯子缺失突變。但是這些為個別案例，總體上腫瘤的驅動基因都是互相排斥的，因為腫瘤也不需要兩種驅動基因驅動其增殖。

3、治療ROS1陽性的克唑替尼

由於ROS1突變與ALK的相似性，研究者很容易想到使用ALK的抑製劑去嘗試治療ROS1的突變。2014年公布的臨床研究數據表明，50名患者每日兩次口服250mg克唑替尼，客觀應答率（ORR）為72%，包含3例患者完全緩解（CR），33例患者部分緩解（PR）。相比ALK突變，ROS1患者使用克唑替尼的反應持續時間更長，達到17.6個月，中位無進展生存期（PFS）為19.2個月，因此專家推出克唑替尼對ROS-1的抑制要強於ALK，而且ROS1陽性突變的患者預後相對較好。

美國FDA於2016年3月11日批准將克唑替尼用於治療ROS1突變的轉移性非小細胞肺癌患者。也是第一個FDA批准的ROS1陽性的靶向藥物。但是克唑替尼治療ROS1陽性的患者也不可避免為會產生耐葯，這些耐葯原因包含ROS1基因上的一些點突變，如G2032R、L2155S、L2026M、G2101A、K2003I、L1951R等。其中ROS1的G2101A、L2026M和G2032R的腫瘤細胞系對Foretinib敏感，但是L2155S對於Foretinib仍然耐葯。G2032R和L2155S細胞系對TAE684也是不敏感的。除去這兩個藥物外，卡博替尼（XL184）展示出與部分耐葯位點的療效，如圖3，ROS1陽性克唑替尼耐葯後的L2026M、L1951R和G2032R可以被卡博替尼所解決，對於ROS1陽性的患者來說這算是一個好的事情，雖然這些是細胞系的研究，但是希望還是有的。這些需要著重注意，基因檢測報告需要仔細查詢是否有這些耐葯位點，這些耐葯位點的釋義和相應的意義。

圖3：ROS1的G2032等突變對卡博替尼敏感

ROS1患者在克唑替尼使用的另一個耐葯機制是EGFR的代償性高表達（表達量為2.6倍），這個在腫瘤細胞系中獲得了驗證，同時使用EGFR的靶向藥物吉非替尼或西妥昔單抗聯合克唑替尼，可以起到協同抑制的作用（見圖4）。

圖4：克唑替尼聯合達克替尼或阿法替尼，可控制部分ROS1患者的耐葯

但是問題是，假如EGFR的高表達也確實是一部分ROS1患者的耐葯原因，什麼時候對患者進行檢測呢，使用什麼樣本檢測。檢測的靈敏度和特異性如何？

鈣粘附蛋白E表達量丟失，波形蛋白和人纖維連接蛋白表達增加是另外一種ROS1陽性患者對克唑替尼耐葯的原因。這導致細胞形態，以及細胞之間的粘附力出現改變。

圖5：一些蛋白表達降低或升高也影響ROS1患者對克唑替尼的敏感性

另外也有文獻報道KRAS、NRAS等也對ROS1陽性的患者使用克唑替尼耐葯，從腫瘤細胞的進化考慮，ROS1對克唑替尼的耐葯原因會是比較複雜的，也比較難以預測。因此究竟是什麼原因耐葯，一定要徹底進行檢測明確。推薦什麼類型的靶向藥物，必須有一定的文獻或臨床數據支持。

4、其他ROS1融合陽性的靶向藥物

ALK和ROS1的激酶活性區域有70%的相似性，因此ALK的抑製劑很多是可以用於ROS1的治療的，克唑替尼這個藥物也就是這麼誤打誤撞地搞出來的。其他的ALK抑製劑是否也可以呢？答案是有抑制效果但不都是。

圖6：ALK抑製劑對ROS1-CD74融合基因的抑制情況

在圖1上我們可以知道CD74是ROS1的主要融合伴侶基因，所以表達該融合基因的細胞系被用來測試ALK的抑製劑。從圖6我們可以看出，克唑替尼、色瑞替尼（LDK378）、AP26113對ROS1-CD74的抑制效果很不錯。ASP3026具有中度的抑制效果，艾樂替尼（CH5424802）沒有顯示出具有抑制活性，這個是為主要注意的，因為艾樂替尼在ALK中和克唑替尼的頭對頭臨床試驗效果很好，但是這並不能完全複製到ROS1陽性的患者上，最起碼不能複製到CD74-ROS1的融合突變的患者上。

很多病友都熟悉3922這個ALK抑製劑，有資料稱這個藥物對於ROS1的抑制力度比克唑替尼強幾十倍。我們查詢了很多的文獻，終於找到了一篇3922對ROS1的報道，給大家呈上。

圖7：不同ALK抑製劑對ROS1的抑制活性，3922最優

從圖7中我們可以再次了解ALK抑製劑對ROS1突變的抑制活性，其實3922可以說是一騎絕塵。當然在這裡我們再一次看到艾樂替尼對ROS1抑制不力，這個是需要著重注意的，不是所有的ALK抑製劑對ROS1都能起到好的抑制效果。

對於ROS1突變導致的克唑替尼耐葯，體外實驗表明3922可以ROS1基因上的G2032R突變、G2026M突變具有抑制效果。在動物模型的體內實驗上，3922對於FIG-ROS1、CD74-ROS1和存在G2032R耐葯突變的CD74-ROS1都具有抑制活性。另外對於FIG-ROS1陽性膠質母細胞瘤的老鼠上也展示出抑制效果。這裡需要注意ROS1有多個耐葯突變，目前報道的是其中兩種是可以用3922控制的，當然這是動物實驗，後續仍需要進行跟蹤了解。

結語：

我們就本帖進行一次重點總結：

ROS1的突變頻率不是很高，在非小細胞肺癌里的頻率僅為2%左右，但是目前有靶向藥物克唑替尼批准。需要明確的是ROS1的突變形式是與其他基因發生融合。但是ROS1本身會產生一些耐葯突變對克唑替尼耐葯，這些耐葯位點可以被其他靶向藥物所解決，如卡博替尼、3922等。目前ROS1在其他癌種也有發現，但是跨癌種用藥的療效如果目前沒有較為全面的報道，有膠質母細胞瘤腦的ROS1陽性老鼠對3922敏感。其他癌種如果檢測出來ROS1陽性，且沒有獲準的靶向藥物，跨癌種用藥也是可以考慮的。

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