單抗糖基化調控之控制參數篇(上)

本文首發葯渡微信，作者: 知行

關鍵質量參數是單抗仿製葯研發的標杆，包括糖基化修飾、聚體、電荷異質性等，其中如糖基化修飾對單抗的生物活性、免疫原性、藥物代謝動力學、構象、穩定性及溶解度具有重要的影響。細胞培養過程中細胞所處環境，如pH、溫度、滲透壓、溶氧等參數會影響到單抗糖基化表現，本文就文獻中對滲透壓、培養時間和溶氧等培養控制參數，以及溫度、剪切力和培養模式對糖基化影響的研究進行了簡要總結。

滲透壓和培養時間

體系中滲透壓的調節可以通過向基礎培養基或補料培養基中加入NaCl實現，從而考察滲透壓對細胞生長、蛋白產量及質量的影響。Efren Pacis團隊將基礎培養基滲透壓分別配製為300、330、360和400 mOsm/kg，補料培養基的滲透壓為750和1250 mOsm/kg，並取不同時間段的樣品進行檢測，進而就滲透壓及培養時間對蛋白糖基化的影響進行研究，實驗過程中採用的為CHO細胞。

以滲透壓為300 mOsm/kg的基礎培養基和750 mOsm/kg的補料培養基為對照組，如圖1所示，D22天時對照組的Man5為15%，而當基礎培養基的滲透壓為400 mOsm/kg時其Man5為18%；相似條件下，而將補料的滲透壓增加到1250 mOsm/kg時，Man5的比例增加到23-27%。而G0F的表現則剛好相反，滲透壓升高時會導致更低的G0F比例，不同滲透壓條件下G1F的差異性並不大。Efren Pacis的實驗中，隨著滲透壓的增加，Man5增加，G0F降低，G1F波動較小，研究人員在CHO-B、C、D和E中均發現了類似的情況。

圖1 不同基礎培養基(300、330、360和400 mOsm/kg)和補料培養基(750和1250 mOsm/kg)時的糖基化表現(a. Man5; b. G0F; G1F) (來源於參考文獻1)

此外，從圖1中還可以看出，隨著培養時間的增加，Man5呈上升趨勢，而G0F和G1F均表現為下降趨勢，這可能與蛋白的一些自發過程有關。而且，高滲透壓情況下細胞的生長還會受到抑制，蛋白的產量也會降低。由於人類自身細胞表達的蛋白抗體的高甘露糖糖型(Man5-9)一般在5%左右，正常情況下不採取高滲透壓的培養條件。

為解釋滲透壓影響糖基化的機理，研究人員對GnT-1 (N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶I，調控Man5與其他糖類鏈接)的mRNA水平進行了檢測。分別取不同滲透壓實驗組D3、7、12和14的樣品進行測定，檢測結果顯示不同滲透壓組GnT-1的mRNA差異性很小，滲透壓對Man5水平的影響可能是通過影響GnT-1酶活或是影響mRNA的轉錄。

溶氧(Dissolved Oxygen，DO)

作為細胞培養的一個重要參數，一般實驗規模或生產規模中常常設置為40%，但也會存在個例。有學者認為將DO範圍設置在25-50%時是最優的細胞培養條件，即使細胞可能會缺氧；而將溶氧維持在過高水平時會加速過氧化物的形成，對DNA、蛋白和脂質等產生損傷，也會導致細胞生長變差。

有時會因為傳質效果差或細胞對氧需要高而將溶氧設置很高，如60-80%，且不考慮這樣的參數設置是否可以真正的解決問題，先了解下溶氧對單抗糖基化的影響。學者對於DO對蛋白糖基化影響的研究結果也是不一致的，如有學者研究表明低水平DO會降低半乳糖糖基化，而其他研究則指出DO不會影響半乳糖化，可見DO對糖基化的影響還與細胞系等因素有關。

VeronicaRestelli等在2.4/4L的培養體系中研究了3、10、50(對照組)、100和200%的DO對細胞生長、蛋白產量及糖基化的影響，採用CHO-K1細胞系合成促紅細胞生成素(EPO)。

VeronicaRestelli首先用弱陰離子交換柱將EPO進行分離，然後再對得到的蛋白進行唾液酸化程度的分析研究。其檢測結果如表1所示，在所得樣品中唾液酸化水平基本都在83-93%，平均水平為89%。除100% DO的16.37%的非唾液酸化外，其他水平的DO的非唾液酸化基本一致。對EPO不同結構類型(複合型、雜合型和高甘露糖型)的糖基化研究，Veronica Restelli採用了HPLC的檢測方法，結果表明DO的不同設定值對其沒有影響。

表1 DO對EPO唾液酸化的影響

(來源參考文獻2)

不同的DO設定(3、10、50、100和200%)下蛋白的岩藻糖化範圍為75-81%，如圖2所示，當DO為50%或100%時岩藻糖水平最高為80%左右；而當DO為3、10和200%時，蛋白的岩藻糖水平均在75-76%範圍內。即當DO為50%或100%時，岩藻糖化水平最高，隨著DO的增加或降低而逐漸降低。總體來講，Veronica Restelli的實驗研究中EPO的糖基化修飾在較寬的DO範圍內變化較小，類似的環境下實驗中使用的細胞株對DO的耐受性高。

圖2 DO對EPO岩藻糖化的影響

(來源參考文獻2)

Kunkel等研究了DO對IgG半乳糖化的影響，其對三個梯度的DO (10、50、100%)進行了實驗，結果表明提高DO濃度可以促進IgG的半乳糖化，如圖3所示。當DO為10%的G2的含量為12%，而當DO為100%時G2的含量提高到30%，G1的變化隨DO的改變並不明顯。

DO對蛋白糖基化影響的作用機制還不明確，有學者認為DO降低會細胞對UDP-Gal(Uridine diphosphate galactose，尿苷二磷酸半乳糖)的利用率，從而進而進入到高爾基體的前體物降低；還有的認為前期含二硫鍵的重鏈化合物會極大的影響半乳糖化過程。

圖3 DO對IgG半乳糖化的影響

(來源參考文獻3)

溫度(Temperature)

生物反應器溫度是控制細胞生長及蛋白產量的重要手段，細胞培養過程中最佳培養溫度(Temperature, T)一般為37℃左右。培養前期37℃的培養溫度以獲得較高的細胞密度，而當細胞密度接近Peak時，降低溫度至30℃左右是延長對數期的常用手段，以此可以得到較高的蛋白產量。

但是Temp Shift不僅僅可以提高蛋白產量，有研究發現低溫條件下細胞內的蛋白酶及其他毒性酶的活性會降低，從而在一定程度上提高蛋白的質量，下面就Temp Shift對糖基化影響的相關研究進行簡要概述。

Michael等對不同的Temp Shift時間(早期、中期和晚期)對唾液酸含量的影響進行了研究，如圖1所示，降溫時間越晚細胞的Peak VCD越高，但是降溫時間對唾液酸含量的影響幾乎可以忽略。當培養溫度在早期(D3)、中期(D4)和晚期(D5)進行調節時，研究取D11天樣測得的唾液酸含量分別為0.98、0.98和0.92，此外在三種不同方案下的D10和D12天的唾液酸含量基本一致。

即在Michael的研究體系中，D3、D4和D5調節培養溫度對唾液酸沒有明顯的影響，但會影響到細胞的表現，另外研究人員並沒有未進行Temp Shift的實驗對照數據，因此Temp Shift對體系中蛋白糖基化影響的研究並不徹底。雖然Temp Shift對唾液酸總量的影響不明顯，但其對唾液酸的兩種形式Neu5Gc和Neu5Ac的比重有明顯影響。當推遲Temp Shift時間時，Neu5Gc水平明顯降低了29-59%，即影響兩者的相互轉換，但對總體的唾液酸量沒有影響。

圖1 不同的Temp Shift時間對細胞生長(左)及蛋白唾液酸化(右)的影響

(圖片來源於參考文獻4)

在Mariela的另一篇文章中其還研究了CHO-K1-hGM-CSF細胞系對於不同培養溫度，37℃和33℃，對細胞生長、hGM-CSF產量及其糖基化的影響。在實驗組中，研究人員將一組實驗始終維持在37℃進行培養，而另一組是當細胞密度接近Peak時降低溫度到33℃。

研究發現，低溫(33℃)對細胞的活率維持有利，並且33℃時hGM-CSF的最高產量是37℃下hGM-CSF最高產量的6倍。由於培養環境的改變對蛋白的質量有重要的影響，因此研究人員就兩種溫度下hGM-CSF糖基化進行了測定，將hGM-CSF純化和去唾液酸化後對其寡糖(oligosaccharide)結構進行測定，檢測結果如表1所示。hGM-CSF去唾液酸化後的岩藻糖化沒有基本保持不變(16.0→14.2、48.7→50.7%、35.3→35.1%) ；而其去唾液酸後的寡糖結構在溫度調節後沒有明顯變化(18.7→17.0%、32.0→33.4%、32.5→34.0%、16.8→15.6%)，也就表示調節溫度對hGM-CSF糖鏈終端的唾液酸化水平沒有明顯影響。即在Mariela的實驗研究中，將培養溫度從37℃(細胞生長階段)降低至33℃(蛋白表達階段)可以提高細胞的生長狀態，增加hGM-CSF蛋白的產量，同時對hGM-CSF的糖基化影響微弱。

表1 不同溫度時hGM-CSF的寡糖結構比較

(圖表來自於參考文獻5)

剪切力(Shear stress)

細胞培養中剪切力可以被認為是不同流速的、兩個層面的培養液間的摩擦力，細胞在這股「力」作用下可能會提前死亡或溶解。有研究報道剪切力可以對蛋白糖基化造成影響，實驗室小規模培養時剪切力對細胞表現的影響並不明顯，而隨著培養規模的擴大又或是細胞的敏感度培養，工藝轉移或是放大時剪切力成為一個不得不考慮的因素。

攪拌轉速的改變可以直觀地影響剪切力，Senger等研究發現高剪切力可以降低tPA上Asn184位點的糖鏈長度，進而影響蛋白糖基化。Senger研究過程中將tPA的糖基化分為兩種類型，Type I(完全糖基化)和TypeII(部分糖基化)，通過Kinetic分析得出高剪切力作用下會產生兩個結果：tPA蛋白的產量增加；Type II型蛋白比率增加，Type I型蛋白比率降低，即蛋白總體糖基化比率下降。分析其原因，Senger認為高剪切力造成細胞的提前死亡或溶解，導致tPA在ER(糖基化過程先發生於內質網「ER」，再到高爾基體中進一步加工)的停留時間過短，部分蛋白還未完成糖基化過程就已經被釋放到培養環境中，糖基化比率降低。

培養模式

細胞培養模式可分為批培養(Batch)、補料分批培養(Fed-batch)、濃縮補料分批培養(Concentrated Fed-batch)和灌流培養(Perfusion)等，目前應用最多的為Fed-batch模式，Perfusion連續培養模式也漸漸進入人們眼中，培養模式的改進主要集中於控制成本，其對細胞表現及蛋白質量的影響也是需要考慮的因素。

學者Kunkel等在細胞培養模式(Batch, Fed-batch, Perfusion)對細胞生長及蛋白質量影響的研究中發現，培養模式的改變對蛋白糖基化表型具有明顯的影響，其採用細胞CHO DG44生產SEAP進行了相關實驗。從總體的糖基化比率來看，Kunkel發現與Batch和Fed-batch相比，Perfusion培養模式生產的蛋白糖基化比率最高，其可能與培養系統中谷氨醯胺濃度有關，Batch和Fed-batch培養時低濃度的谷氨醯胺限制了糖基化的位點。

而對於高甘露糖型，其在Batch、Fed-batch和Perfusion模式中的比率依次下降，這是由於培養時間長短不一、細胞存活時間不同(Perfusion > Fed-batch > Batch)，在Batch培養中細胞過早死亡導致蛋白提前從高爾基體中釋放，而未完成正常的糖基化修飾。而蛋白SEAP的唾液酸化比率則呈相反的情況，Batch、Fed-batch和Perfusion模式中的唾液酸化比率分別為17.6%、31.6%和50.9%，對於一點作者的解釋是較早的細胞死亡或溶解使細胞質中的唾液酸酶得以釋放，從而將糖鏈末端的唾液酸降解，從而減少了唾液酸化比率。