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控制論登場，解決了合成生物學面臨的一大難題

05-03

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圖片來源：https://www.ima.umn.edu/press-room/control-theory-program-highlights-interdisciplinary-connections

前言

細胞生長的內部環境是動態變化的，這使得構建基因線路或者網路時，在細胞機器中引入的元件難以實現穩定的輸出，如眾所熟知的啟動子。近期在Nature Biotechnology發表的一篇文章，來自MIT的合成生物學著名學者Christopher Voigt實驗室的研究人員運用控制論理論設計了能夠在任何拷貝數下實現目的基因同一水平表達的啟動子元件。理論證明，如果負反饋（Negative regulation）處於完美的非協同狀態（non-cooperative），那麼目的基因實現對拷貝數的非依賴性可以通過非一致前饋環（incoherent feedforward loop, iFFLs）實現。研究人員利用transcription-activator-like effectors (TALEs)構建了iFFLs穩定的啟動子（iFFLs-stabilized Promoters）。結果表明，即使基因的拷貝數由於基因組突變或者培養基條件改變發生了變化，這些iFFLs穩定的啟動子控制的目的基因在不同的基因組位點或者質粒上仍能實現接近相同的表達水平。研究人員最後將這些穩定的工程化啟動子應用到了涉及三個基因的Deoxychromoviridans代謝通路中。結果表明，由於iFFLs穩定的啟動子的作用，將工程化的代謝通路從質粒上轉移到基因組上時可以實現相同的表達水平，並且轉移的過程無需經過任何調諧。

工程化的基因線路或者調控網路在細胞機器中實現穩定的表達或者輸出往往困難很大，因為生長條件的改變、不同的生長時期、基因表達的差異、代謝負擔或者環境壓力均能影響目的基因的表達水平。基因表達水平同樣也會受到拷貝數（Copy Number）的影響。不同的複製原點都有其特殊的自我複製起始機制，這就意味著不同的質粒拷貝數會產生差異。那麼將要表達的基因整合到基因組上是否可以解決這個問題？答案是否定的，因為離基因組的複製原點的遠近也會影響基因的表達水平。快速分裂的細菌會同時進行多份基因組的複製，這會導致基因組的部分區域（如接近複製原點的區域）在同一個細胞中會存在多種拷貝，所以靠近基因組複製原點的相關基因可能會產生富集。研究表明，基因組上不同位點的平均拷貝數差異最高可以到達8倍（取決於細胞分裂的速度）。所以如果可以減少或者消除DNA拷貝數對基因線路的影響，這將提高整個合成系統的魯棒性，同時當我們需要在不同系統、不同位置間轉移基因線路時可以避免反覆的調諧。

面對這個難題，Thomas H Segall-Shapiro , Eduardo D Sontag和Christopher A Voigt通過利用系統和控制理論，用一個精妙的方法解決了基因表達水平受質粒拷貝數影響的難題，相關的工作發表在《Nature Biotechnology》。

實現高魯棒性基因表達的方法主要有兩種，第一種是改造質粒的複製原點使質粒本身的拷貝數保持穩定；第二種方案是調諧基因表達的調控模塊，包括啟動子的強度、核糖體結合位點(RBS)的強度、RNA和蛋白質的降解速率。儘管這兩種方法可以在一定程度上提高基因線路或者網路的魯棒性，但是這兩種方案相對來說工程量大，耗時長，需要反覆嘗試，並且特定的質粒或者基因網路往往需要特定的調諧方案。同時，當我們把調諧好的基因線路轉移到另一種質粒或者基因組上時，我們幾乎肯定需要另一輪的調諧過程來克服拷貝數變化所帶來的問題。

組成性啟動子產生的基因表達的整體水平大致能夠反映基因在細胞的拷貝數情況。我們可以讓啟動子聯合額外的元件來解耦基因表達和拷貝數的依賴關係，實現啟動子的穩定化（Promoter Stabilization）。啟動子的穩定化需要引入新的調控機制：此調控機制需要響應拷貝數的變化，並且根據變化相應的調控啟動子的強度。這一點可以通過Autoregulatory feedback、Integral feedback或者Incoherent feedforward loops（iFFLs）實現。比較這三種方案時，研究人員有兩點考慮：1.設計的可行性；2.實現完美適應的能力（也就是說，任何拷貝數下都傾向於實現目的基因的恆定表達水平）。儘管Autoregulatory feedback在實現目標上很直接，但是如果沒有無窮大的協同抑制（infinitely cooperative repression），這種方案就不能實現完美的適應，並且這種方案有可能產生震蕩。相反的，Integral feedback能夠實現完美的適應，但是在具體實現上過於複雜。

從左到右依次是：Autoregulatory feedback、Incoherent feedforward loops（iFFLs）和Integral feedback拓撲結構圖。概念圖製作：孫智。

科研人員最終選擇了iFFL方案，因為這種方案簡單，理論上可以實現完美的適應，同時其功能在多種實驗中都得到了驗證。Feedforward loops在自然的轉錄網路中普遍存在，並且已經應用於大量的工程化系統中。之前，Benenson et al.曾利用轉錄和轉錄後iFFLs部分解耦了基因表達水平和轉化進哺乳細胞的DNA量的關係。相似的設計也表明iFFLs可以減少由生長差異導致的基因表達水平的變化。

在發表在《Nature Biotechnology》的這篇文章里，Segall-Shapiro et al.報道了一組利用iFFLs拓撲結構實現了穩定化的啟動子。無論基因的拷貝數如何變化，這些啟動子能夠保持目標基因幾乎恆定的表達水平。

Segall-Shapiro et al.認為建立完美的iFFLs穩定的啟動子系統需要兩種條件。首先，抑制蛋白的動態範圍(Dynamic Range)必須很廣。在這種情況下，目的基因的表達水平將會和拷貝數(c)成為正比例關係，而和抑制蛋白(R)的水平成反比例關係，所以目的基因的表達水平G=c/R^n，其中n是抑制蛋白結合相應啟動子的協同程度(Degree of cooperative)。如果抑制蛋白的表達受到組成型啟動子調控，所以R將會和拷貝數c成為正比例關係，則G∝c^(1-n)。所以，也就是第二點，當n=1（抑制蛋白處於非協同性效應）時，G∝1，也就是說目的基因的表達水平將不再依賴於拷貝數。

(a)本實驗中的iFFLs拓撲結構:拷貝數同時影響抑制蛋白和目的基因的表達；抑制蛋白消除拷貝數對目的基因表達的影響；（b）當n= 0.5, 0.75, 1，1.25 和1.5時，目的基因和抑制蛋白的相互關係。（c）當n= 0.5, 0.75, 1，1.25 和1.5時,目的基因表達水平和拷貝數的相關關係。

在這篇文章中使用的TALE抑制蛋白則滿足了這兩種條件。TALE蛋白通過設計能夠以結合單個DNA操縱子的方式抑制相應的啟動子，同時具有較寬的動態範圍（能實現~100倍的抑制效果）。重要的是，TALE蛋白作為單體可以以非協同的方式在大腸桿菌中發揮作用。

利用iFFLs拓撲結構，作者通過設計TALE抑制蛋白使其結合到目標基因的啟動子區域。接下來，組成性表達的啟動子序列被克隆到目的基因啟動子的上游區域。由於拷貝數的改變能夠同時影響目的基因和抑制蛋白的表達水平，所以iFFLs拓撲結構可以用來穩定輸出信號的表達水平。例如，如果拷貝數增加，那麼抑制蛋白的表達水平也會增加，這樣一來，增加的抑制蛋白可以用來下調目的基因的表達水平。

為了驗證iFFLs設計的可行性，作者以GFP為對象檢驗了設計的效果。他們將普通的啟動子(Not Stabilized)和iFFLs穩定的啟動子放在拷貝數從1-100不等的質粒上，比較GFP熒光的變化情況。

實驗中用的啟動子設計。Core：最小啟動子的組成組分；Constitutive（Insulated）：組成性啟動子，用於實驗中常規表達目的基因，受拷貝數的影響。同時加入了絕緣子元件，用於絕緣其他序列的影響；Stabilized：iFFLs穩定的啟動子，包括啟動子、靶向啟動子序列的TALE蛋白，和絕緣子元件。

結果表明對照組啟動子調控的GFP蛋白的表達水平和拷貝數成正比例關係，隨著拷貝數改變而改變。當GFP基因位於基因組上時，表達水平也會由於離基因組ORI的遠近而發生變化。然而，當GFP的表達由iFFLs穩定的啟動子調控時，無論是在不同拷貝數的質粒上還是不同的基因組整合位點，GFP的表達基本都是恆定的。同時研究還有額外的收穫，iFFLs穩定的啟動子不僅僅能夠克服拷貝數變化帶來的干擾，它也能使得GFP的表達水平在不同的培養條件、或者宿主存在影響全局RNA穩定性的基因突變時維持恆定。

相比於對照組未穩定化的啟動子，iFFLs穩定化的啟動子在（a）質粒拷貝數不同，（b）質粒種類不同，（c）TALE抑制的啟動子不同，（d）目的基因不同，（e）基因組插入位點不同時均能保證目的基因恆定的表達水平。

接下來，作者通過將三個基因組成的代謝通路(Prodeoxyviolacein)從質粒上轉移到到基因組上，證明了iFFLs穩定的啟動子也可以用來維持多個基因的穩定表達。重要的是，結果表明在沒有任何調諧的情況下，無論是在質粒還是基因組上，代謝產物的產量都維持在了穩定的水平。

在沒有任何調諧的情況下，無論是在質粒還是基因組上，代謝產物Prodeoxyviolacein的產量都維持在了穩定的水平。

由於這種結構的良好結果，iFFLs穩定的啟動子可以用來克服一系列影響抑制蛋白和目的基因表達速率的干擾。例如，如果遊離的核糖體數量的下降影響了目的基因的翻譯速率，那麼TALE蛋白在翻譯速率上同等水平的下降將減少其本身的抑制效果，進而提高目的基因的轉錄速率。這樣一來，目的基因在翻譯速率上的影響就可以被轉錄速率的提升抵消掉了。

當然這種設計也存在著一定的限制。iFFLs的一個限制是它們不能克服類似於Ribosomal traffic jams，anti-sense RNA inhibition或者enzymatic mRNA and protein degradation的干擾，因為這些干擾以不對稱(asymmetrical)的方式作用於TALE抑制蛋白和目的基因。在工程化基因線路和網路變愈加複雜時，這種不對稱效應有可能成為一個愈加複雜、繁瑣的問題。

iFFLs的另一個限制是回溯活性(Retroactivity)。具體來說，當基因線路或者網路中存在多個iFFLs穩定的啟動子時，多個抑制蛋白結合位點將會使可獲得的TALE相互分開，也就是說作用於同一位點的TALE蛋白的濃度降低。這一點將會限制我們可以在同一線路或者網路中所能使用的iFFLs穩定的啟動子數量。

實現基因在不同環境下的恆定表達是合成生物學領域一個長期存在的挑戰。而iFFLs穩定的啟動子可以用來解決此難題。這使得我們在一定程度上，可以在不同的拷貝數或者不同的培養條件和壓力下維持目的基因表達水平的恆定。加入iFFLs拓撲結構讓基因線路或者網路的可移植性成為現實，不僅僅是在質粒或者基因組上，同時也有可能在不同的物種間實現。

參考文獻：

1. Segall-Shapiro, Thomas H., Eduardo D. Sontag, and Christopher A. Voigt. "Engineered promoters enable constant gene expression at any copy number in bacteria." Nature biotechnology (2018).

2. Tomazou, Marios, and Guy-Bart Stan. "Portable gene expression guaranteed." Nature Biotechnology 36.4 (2018): 313.

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