學習與記憶（三）：罕見神經發育遺傳病——天使綜合征

一、什麼是罕見神經發育遺傳病

大約有2～3%的兒童有智力障礙（intecllectual disability），而70%的智力障礙是由基因變異導致的。目前，已知有600多種基因能成為智力障礙的誘因。

1985年，人們發現了第一個神經發育的致病基因。此後，智力障礙才得以被診斷出來。2000年，由於人類基因組計劃的開展，越來越多的神經發育致病基因被發現，從而引領了神經發育障礙診斷的第二次飛躍。

對神經發育的研究也許無法治癒智力障礙兒童，但是可以大幅改善其生活質量。這也是進行神經發育研究的意義之一。

下圖列出了目前已知的神經發育障礙致病基因，他們大多數與RAS/ERK/mTOR分子通路有關。其中，NF1基因變異最有可能導致神經發育障礙，病情也最嚴重。兩個原因：

1）NF1基因表達的是NF1蛋白，即神經纖維素I（Neurofibromin I）。從圖中我們可以看到，它處於許多分子機制的上游，因此一旦變異，就會使下游的許多過程發生變化；

2）許多影響神經發育的蛋白都是興奮性的，但NF1蛋白為抑制性蛋白。當它無法起到正常起作用時，其調控的下游通路會出現功能增益（gain of function），過度活躍，過度合成蛋白。

合成的蛋白增多很可能就會出現如蛋白質聚集等擾亂細胞正常工作的錯誤。如果只是其中一個興奮性蛋白出了問題，雖然可能導致功能減弱（loss of function），但很有可能有其他功能相同或相似的蛋白能夠起到補償作用。

CaMKII變異對神經發育障礙的影響是直到去年才被檢測出來的（Küry et al., 2017）。明明我們在二三十年前就知道了它的存在，為什麼現在才發現它的變異導致的致病影響呢？這是因為許多其他基因的變異會發癌變，使患者表現出明顯的軀體癥狀，從而容易對患者進行識別和歸類。對多個相同癥狀的患者進行基因檢測，就容易得知他們的共同致病基因。這也是為什麼許多神經發育障礙的名字中都有「綜合征」字樣，如天使綜合征等。但是CaMKII的病變不如其他明顯，難以將該類病變人群歸類，因而難以檢測致病基因。

二、CaMKII對疾病的影響

1. 天使綜合征（Angelman Syndrome，AS）

AS的發病率為兩萬分之一。患者表現出智力障礙、言語缺失、癲癇及EEG異常、運動缺陷、睡眠缺陷和行為異常（如自閉症譜系障礙[Autism spectrum disorder, ASD]、進食障礙、睡眠障礙等）。不過，患者們總是常常面露笑容，有天使般的神態。巧合的是，首先發現該疾病，並系統描述它的醫生Harry Angelman，其名字里也有「天使「一詞。

AS是由神經系統內母本15號染色體上UBE3A基因功能缺陷無法正常表達而導致的。

UBE3A蛋白（Ubiquitin-protein ligase 3A）就是E6AP蛋白，是泛素蛋白連接酶3型的一種。泛素-蛋白溶酶體是生物體內降解蛋白質的兩種途徑之一，另一種是自噬-溶酶體途徑。降解蛋白質與細胞周期、免疫應答、代謝物清理等有關。簡單來說，泛素-蛋白溶酶體途徑是通過3種酶活化泛素，並將其連接到被降解的蛋白質上做好標記。這樣，被標記好的蛋白質就會被送回工廠分解回收。其中的一種酶，泛素蛋白連接酶3型，就負責將活化的泛素連接到即將被降解的蛋白質上。當然了，蛋白質種類繁多，你很容易就猜到，這個連接酶一定是有特異性識別功能的。UBE3A是眾多連接酶中的一種，但目前，其關鍵靶向未知。它最初是在關於人類乳頭瘤病毒（HPV-16）發病機制的研究中被發現的，那個時候的名字是E6AP（E6-associated protein），故事相當有趣，感興趣的可以去查閱相關內容。

目前，研究者們通過基因打靶（gene targeting）敲除母本UBE3A基因後獲得了天使綜合征的小鼠模型。這種小鼠模型除了無法表現出言語缺失外完全模擬了人類天使綜合征。

2. CaMKII對天使綜合征的影響

研究發現，降低AS小鼠中增高的CaMKII T305位點上的抑制性磷酸化能恢復AS表型（Weeber et al., 2003; Van Woerden et al., 2007）。也就是說，CaMKII的活性在天使綜合征中被抑制了。那麼是因為這個才導致了神經疾病嗎？

一個簡單的想法是，讓我們移除AS小鼠中的CaMKII的剎車吧。看看提高CaMKII活性會發生什麼！

研究者讓攜帶UBE3A基因的AS小鼠與αCaMKII-TT305/6VA小鼠（αCaMKII T305位點無法進行抑制性磷酸化）雜交，雙方均為雜合小鼠。這樣會產生四種基因型的小鼠：

• 健康的野生型小鼠（WT）；
• 健康的只攜帶一個αCaMKII變異基因的小鼠（αCaMKII）；
• 病態的只攜帶父本UBE3A的AS小鼠（AS）；
• 攜帶父本UBE3A及父本αCaMKII變異基因的小鼠（AS/αCaMKII）。

AS小鼠會表現出肥胖、癲癇、運動協調障礙和認知缺陷。而：

• AS/αCaMKII小鼠沒有出現肥胖；
• AS/αCaMKII小鼠的癲癇發作顯著減少；
• AS/αCaMKII小鼠在衡量運動協調的平衡桿和轉動桿任務中表現明顯比AS小鼠好，接近野生控制組水平。令人意外的是，αCaMKII變異小鼠甚至還在運動協調能力上表現出大幅提升;

• 在用以測試空間學習能力的Morris水迷宮實驗中，AS/αCaMKII小鼠比AS小鼠好，與野生控制組無差異；
• 在恐懼學習（環境條件化）實驗中，AS小鼠學習認識危險環境更慢，但AS/αCaMKII小鼠和野生控制組表現出相同水平的學習能力；
• AS/αCaMKII小鼠和αCaMKII小鼠的LTP水平均與野生控制組無差異，而AS小鼠則沒有LTP；

因此，我們可以下結論說，AS/αCaMKII雙重變異拯救了AS單一變異的CaMKII活動性、LTP缺陷、肥胖癥狀、癲癇癥狀、認知缺陷和運動協調缺陷。

既然如此，那AS是一種病症可逆的發育性綜合征嗎？

天使綜合征目前的治療方案研究主要走以下兩條路：

• 調節下游靶位或效應器（如CaMKII）的藥物
• 激活父本UBE3A基因的藥物

3. 基因印刻（gene imprinting）與天使綜合征

為什麼要激活父本UBE3A基因？

我們之前提到，AS是一種母本UBE3A基因無法正常表達的疾病。我們知道，每一對染色體都包含一條母本拷貝和一條父本拷貝，但它們的貢獻在某些情況下不是對等的。在除神經系統外的其他部位，母本和父本染色體上的UBE3A基因都能正常表達，而在神經系統中父本基因拷貝被組織特異性沉默了，也就是被印刻了。

可能有人看到印刻就會想起「小鴨認媽」的中學生物學教材的典例，樓主表示，從心理學跑過來，在課上第一次聽到「gene imprinting」，以為基因都會認媽，而旁邊同學們還點頭表示很懂，於是恍恍惚惚驚到懷疑世界，手機查了好幾遍imprinting這個詞。但是吧，它的意思勉勉強強也差不多，就是說這個基因一開始就被封印了，不許說話。

1997～1998年的一系列遺傳學研究表明，神經系統過多表達UBE3A會導致自閉症。這大概就是為什麼神經系統沉默了其中的一個基因。

沉默基因的方法有好些，其中最普遍的方式是甲基化修飾其DNA區段。但UBE3A的印刻並不是這樣的。它很特殊。Beaudet實驗室在2015年發現，與父本UBE3A基因反向的一個位點會表達一個非編碼RNA（UBE3A-ATS，不編碼蛋白質），這個RNA會一直產生覆蓋UBE3A基因的部分，導致它無法正常表達。這個過程叫反義轉錄（anti-sense transcript）。這名字也是很有趣了，anti-sense之後這基因果然無法make sense。

所以就有人說，那我們去掉這個反義轉錄，解除封印，讓父本UBE3A正常表達，不就可以彌補母本UBE3A的表達缺陷了嗎？

確實，黃憲松博士用拓撲異構酶抑製劑Topotecan確實能有效打開沉默的父本UBE3A，緩解AS癥狀，但是這種藥物的毒性較大，目前仍需改善，另外，反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide, AON/ASO）也能調節降解UBE3A的反義轉錄，且基本上能完全恢復UBE3A的表達（相關研究文章尚未公開發表）。

另一個問題是，AS表型的可逆性是否存在一個關鍵期？什麼時候用藥最有效？要怎麼研究？

4. AS表型可逆性的關鍵期

研究者創造了一種Tamoxifen-Cre AS小鼠。在正常小鼠的母本UBE3A基因中用Cre-LoxP方法插入一個帶標記停止子後，UBE3A無法正常表達，此時小鼠就是AS表型的小鼠；若給予藥物Tamoxifen，則能啟動Cre重組酶，剪掉停止子，讓UBE3A基因正常表達。如此一來，在不同時期給予Tamoxifen，就能觀測到不同時期AS表型的可逆性了！

結果發現，在任何年齡（幼年、青少年期和成年期）恢復UBE3A表達都能拯救海馬LTP缺陷；前額葉皮質第5層錐體神經元的突觸傳遞缺陷可在成年期恢復UBE3A表達時被拯救；運動缺陷只能在幼年時期恢復基因表達來拯救；築巢行為缺陷在小鼠三周齡後恢復基因表達而被拯救。簡單說，確實越早越可逆，救比不救要好。

那麼，UBE3A在神經元發育完成後還有作用嗎？

檢驗的操作時，用Tamoxifen-Cre、LoxP夾心UBE3A基因替換野生型母本基因，這樣在不同年齡時期給予Tamoxifen就可以剪掉整個UBE3A基因，使它從正常小鼠變成AS小鼠。

結果是，早期發育時敲除基因會導致AS表型，3周齡後敲除只會影響到突觸可塑性、築巢行為和強迫游泳表現，12周齡後敲除僅影響突觸可塑性。

至此，我們可以得出有關治療方案和窗口期的結論：

• 用ASO可以恢復UBE3A基因表達
• 臨床試驗需考慮到某些待拯救行為方面的發育窗口期
• 絕大多數AS小鼠的表型在出生後的發育期內表現出來，但UBE3A蛋白對成年鼠的正常突觸可塑性來說也是必不可少的。

有時間再整理一下基因編輯實驗小鼠的幾種方法吧。

參考文獻：

Küry, S., van Woerden, G. M., Besnard, T., Onori, M. P., Latypova, X., Towne, M. C., ... & Stessman, H. A. (2017). De Novo Mutations in Protein Kinase Genes CAMK2A and CAMK2B Cause Intellectual Disability. The American Journal of Human Genetics, 101(5), 768-788.

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Weeber, E. J., Jiang, Y. H., Elgersma, Y., Varga, A. W., Carrasquillo, Y., Brown, S. E., ... & Sweatt, J. D. (2003). Derangements of hippocampal calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome. Journal of Neuroscience, 23(7), 2634-2644.

Van Woerden, G. M., Harris, K. D., Hojjati, M. R., Gustin, R. M., Qiu, S., de Avila Freire, R., ... & Weeber, E. J. (2007). Rescue of neurological deficits in a mouse model for Angelman syndrome by reduction of αCaMKII inhibitory phosphorylation. Nature neuroscience, 10(3), 280.

Meng, L., Ward, A. J., Chun, S., Bennett, C. F., Beaudet, A. L., & Rigo, F. (2015). Towards a therapy for Angelman syndrome by targeting a long non-coding RNA. Nature, 518(7539), 409.

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