手把手帶你邁過「細胞周期」流式檢測的門檻

開始講周期檢測前先帶大家回憶一下細胞周期的基本知識（高手可自行跳過）。

細胞周期(cell cycle)是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為分裂間期(interphase)和有絲分裂期(mitosis)兩個階段。

分裂間期分為三個連續的階段：第一階段稱為 G1期，細胞對環境進行「監測"，當接收到必要的信號後，細胞便開始合成 RNA和蛋白質來誘導細胞生長；一旦條件合適細胞便進入S期，開始合成 DNA和複製其染色體 DNA，使體細胞成為4倍體，與此同時還合成組蛋白，進行中心粒複製，S期一般需幾個小時；最後在 G2期細胞持續生長並準備進行有絲分裂，中心粒已複製完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等，G2期比較恆定，需用1～1.5小時。

有絲分裂需經前期(prophase)、中期(metaphase)、後期(anaphase)和末期(telophase)，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

此外還有G0期，G0期是細胞暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執行一定生物學功能的細胞所處的時期。

我們之所以能夠對細胞周期進行檢測主要就是根據周期不同階段細胞DNA含量不同的原理進行檢測，此外這個過程中一些蛋白的表達水平也會發生變化，亦可以成為周期檢測的輔助手段。

1. 基本方法--單參數檢測周期

檢測周期最簡單、最基本的方法就是利用DNA染料，如PI、7-AAD等（各染料特徵見文末附表）對細胞進行染色，DNA含量多則熒光強度高，DNA含量低則熒光強度低，根據熒光強度的變化就可判斷細胞處在周期的哪個階段。理想狀態下，如果G0/G1期細胞的熒光強度為N，則S期細胞的熒光強度處於N～2N之間，G2/M期細胞的熒光強度為2N，如圖示：

但實際情況則如下圖所示：

實際的圖形中各期的細胞和理想情況相比都具有一定的寬度，這是由於細胞染色和激光照射不完全均一等原因所致，通常用變異係數(CV)來衡量，一般來講CV值應該小於3%。這就帶來了一個問題，圖中紅色圓圈部位的細胞到底處於哪個周期？解決方法是計算機上的周期分析軟體可以利用數學模型通過一定的演算法對結果進行分析，從而估算出各階段的細胞比例。

下圖為BD公司的Modfit軟體分析得到的結果：

如果上述方法得到的結果已經能夠滿足你的需要，請點擊返回鍵退出閱讀。但如果你有追求完美的處女座性格，並不滿意計算機通過數學模型估算出的結果，請繼續閱讀周期檢測的「進階方法」。

進階方法--雙參數檢測周期

為了克服單參數法不能真實的反映出周期不同階段細胞的比例這種困境，BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)，一種胸腺嘧啶核苷類似物，被引入了周期的檢測方法中。BrdU能夠在DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶(T)，進入正在複製的DNA中，而後利用抗BrdU抗體便可對其進行檢測，這樣便可明確將S期細胞與G0/G1期細胞和G2/M期細胞進行區分。

但BrdU需要變性DNA後才能與抗體結合，破壞了DNA雙鏈結構，影響了Hochest等染色，導致染色彌散，準確性降低等問題，逐漸被EdU取代。EdU是另外一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷。

看似問題已經得到了解決，那麼關於細胞周期檢測我們還能做得更好嗎？

答案是肯定的。因為上述方法都不能對G0期和G1期的細胞進行區分，亦不能對G2期和M期的細胞進行區分。為了實現這個目標Christine Vignon等人發明了一種三參數雙熒光的檢測方案。除了常規的DNA染料7-AAD，研究人員引入了Ki-67和磷酸化組蛋白H3這兩個指標，Ki-67在G0期不表達可以用來區分出G0期細胞，Ser10磷酸化的組蛋白H3與染色體凝縮高度相關可用來區分出處於M期的細胞。詳情請見圖：

上述方法基本上可以滿足大部分研究者對於周期研究的需求，至於對周期更極致的區分已經超出了小編的能力範疇，就不再獻醜了。

雙參數法都可以怎麼玩？

雙參數法雖然對周期的區分不如三參數法細緻，但根據不同的實驗目的還是能夠玩出一些不一樣的感覺。

如果你想知道在給定時間裡有多少個細胞處於周期循環中，您可以將細胞暴露於BrdU下較短的時間(如30分鐘)，然後進行檢測。這樣你就可以比較同種細胞接受不同處理方式後周期各個階段細胞百分比的差異，或者比較不同細胞類型間的差異。

如果你想知道培養的細胞中是否有靜止的，未進入周期循環的細胞，可將細胞暴露於BrdU較長一段時間(例如24小時)後再進行檢測。任何BrdU陰性的細胞都是未進入細胞周期循環的靜止細胞。

如果你對細胞跨越周期不同階段所需時間感興趣，您可以將BrdU添加到培養液中15分鐘，然後換成不含BrdU的培養液。在不同時間點取樣品進行檢測。追蹤實驗開始時BrdU陽性的處於S期的細胞，比如當你看到標記的細胞重新出現在G1期，你就知道該細胞通過G2和有絲分裂期用了多長時間。

附：常用DNA染料及其特點