人工合成生命的一小步：人工設計和合成最小細菌基因組

2016年，一個研究團隊發表了一篇關於壓縮細菌基因組的文章，被視為繼人工合成（純有機合成，沒有生物過程參與）細菌基因組後，人工合成生命的又一小步。

一、基因組壓縮

1.自然的基因組壓縮過程

為了能夠在環境中持續生長和繁殖，細菌除了維持基本的生命活動，肯定還發生了各種適應性進化。對於在複雜環境下生存的細菌，「適應基因」佔據了它們基因組的主要部分，使得它們的基因組不斷擴張，比如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，它們的基因組約有4000~5000個基因。

但是，對於在簡單環境中的細菌，情況恰好顛倒過來，適應在它們的生命周期里不那麼重要，因此它們就會自發地不斷壓縮自己的基因，降低基因組的大小。最典型的代表就是支原體，專一的寄生環境使得它們在進化中不斷刪減自己的基因組（同時也不斷降低自己的物理大小，支原體是目前已知的最小的獨立代謝細胞）。在1995年，生殖支原體（Mycoplasma genitalium）的全基因組測序完成，結果顯示：它具有525個基因，大約580kbp（bp即base pair，鹼基對）——這在很長時間內保持了人類已知的最小基因組記錄。

2.基因組壓縮的意義

既然基因組可以壓縮，一個很自然的想法就是基因組的壓縮是否存在極限。如果存在，找到這個極限對應的最小基因組就具有非常的意義：它將幫助我們建立一個「純粹的」細胞模型。從這個模型出發，我們能夠更好地理解生命的核心功能，解析生命在最底層的架構上是如何組織的，向人工生命設計和合成邁出一大步。

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二、基因組壓縮的技術準備

1.基因可壓縮性的估計：比較基因組中的保守核心

研究者對流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza，1825個基因）和生殖支原體（Mycoplasma genitalium，525個基因）進行了比較基因組學分析。分析顯示，二者存在共計約250個同源保守基因。對於遺傳差距如此之大的兩種細菌而言，這些基因都不怎麼發生進化，說明這個保守核心很可能也是生命必要基因的核心（需要特別指出的是，保守基因不等同於必需基因，這個將在後面展開）。

2.基因類型的劃分

一個很樸素的分類方法就是把基因分為必需基因（essential gene）和非必需基因（nonessential gene）。在人工維持的實驗環境（培養基）下，缺失導致死亡的就是必需基因，缺失不致死的就是非必需基因。這種劃分很有效，通過本文介紹的技術也很容易把它們區別開來。早期研究人員就是以這種思路為指導，把所有的非必需基因都敲掉了。但很快他們發現一個問題——菌落長不起來。通過進一步的實驗，他們發現，非必需基因中有很大一類基因，它們的缺失不會導致細胞直接死亡，但卻會造成細胞生長分裂困難。因此，研究人員引入了一個新的概念，准必需基因（quasis-essential gene），用來標記一類維持細胞穩定生長的基因。

准必需基因的存在預示了一個問題：人工壓縮基因組必須要權衡兩個因素：基因組大小和生長速率。我們不計代價地壓縮基因組可能導致細胞無法生長，但如果過多地考慮生長那基因組又可能顯得過於冗餘。

3.如何確定哪些基因是可以刪減的？全域轉座子誘變技術。

要想對基因組進行壓縮，那我們必須知道哪些基因可以刪（非必需基因），哪些基因不能刪（必需基因，部分類必需基因）。這就需要引入一種甄別技術：全域轉座子誘變技術（global transposon mutagenesis）。

· 技術簡介

利用轉座子在基因組上隨機插入的特點，可以打斷或者修飾某個表達基因的功能，誘導突變。相比於傳統的誘變方法（比如X射線誘變、化學誘變），它的優點主要有：（1）突變率更高，致死率更低。（2）可以製造單突變。（3）可包含選擇基因（用來篩選發生了突變的菌株）。（4）可以回復突變。但它的局限還是存在的，比如轉座現象在生物中不太常見（只有真核生物有轉座現象），並且突變仍然比較隨意（在本文中，這種隨機性反而是一種好處）。

· 技術應用思路

對syn1.0進行大量擴增，然後進行全域的轉座子誘變，使得整個基因組被轉座子插得「千瘡百孔」，然後對這些syn1.0進行培養。可以想像，必需基因被插入後細菌必死無疑，而非必需基因被插入後細菌還能在培養基上苟延殘喘。對存活下來的細菌基因組測序，然後與syn1.0進行比較，很容易得到必需基因和非必需基因的區分：「完好無損」的基因肯定是必需基因，「插成篩子」的基因肯定是非必需基因。

· Tn5轉座子系統

很明顯，細菌是沒有轉座系統的，所以我們需要設計一個轉座子系統，裡面含有轉座酶基因，使得轉座現象能夠在細菌裡面發生。本文中採用的轉座子系統是Tn5轉座子系統，圖示如下。

其中，IS50R編碼兩種蛋白，Tnp和Inh。Tnp是轉座酶，而Inh是它的抑製劑。Inh只比Tnp少55個氨基酸，這一段序列恰好位於轉座酶和DNA結合的結構域（就是結合位點的一部分）。OE和IE序列是轉座酶發生作用的關鍵序列。IS50R和IS50L中間夾著的是選擇基因（比如抗生素抗性基因）。

· 其它

早期研究組還使用scarless TREC(tandem

repeat coupled with endonuclease cleavage)進行基因組的刪除（集運CRISPR/Cas9技術和同源重組），但很快研究組基於效率的考慮放棄了這種方法，但這種方法開拓了視角，並且為研究設計積累了經驗。

4.基因壓縮的素材和「容器」

· 研究素材

在正式開工之前，我們肯定還需要一個天然的模板。自然地，我們把目光投向了目前已知最小的細胞生命——支原體。雖然前面提到的生殖支原體的基因組比較小，但是因為它長得太慢了，所以研究人員選擇了長得更快的絲狀支原體（Mytoplasm mycoides），方便早期篩選工作的進行。2010年，該研究團隊完成了對絲狀支原體基因組的全化學合成和安裝（這項工作被視為人工合成生命的開端），共計1078809bp（1078.09kbp），命名為JCVI-syn1.0，作為本文基因組壓縮設計和合成的原始模板。

· 受體細胞（「容器」）

人工設計和合成的基因組最後要注入生物體內才能發揮作用，驗證它是否具有生物學功能，研究團隊選擇的受體細胞是做成「空殼」的山羊支原體（ Mytoplasm capricolum）。

· 其它序列

由於合成、植入還有商業生產的需要，基因組內還有一部分DNA為載體序列、標記基因還有水印序列（類似紙幣的水印，標記商業專利）。

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三、設計與合成工作流——DBT循環

1.DBT循環

DBT循環即Design-Built-Test（設計-構建-測試）循環。根據以前分子生物學研究的結果、全域轉座誘變實驗結果，研究者可以獲得一個非必需基因（不含准必需基因）的名單，然後設計刪減後的基因組，再進行基因組合成和組裝，最後植入受體細胞進行測試。

2.Design環節：基因組壓縮策略

在設計之前，研究團隊會積累大量的分子生物學實驗數據，尤其是之前提到的全域轉座子誘變實驗獲得的結果。基於這些數據，研究團隊會基於一系列壓縮策略對目標基因組進行設計。設計策略主要有：

(i) 一般地，每個非必需基因的編碼區域（包括起始密碼子和終止密碼子）都會被刪除，例外將在下面陳列。

(ii) 如果一個基因簇（連續排列的基因）中不止一個基因被刪除，那麼它們的基因間序列也會被刪除。

(iii) 毗鄰被刪除基因或者連續基因簇的序列會被保留。

(iv) 如果存在被刪除的基因與其它基因重疊，那重疊部分會被保留。

(v) 如果被刪除基因包含未被刪除基因的核糖體結合位點或者啟動子，那部分序列會被保留。

(vi) 如果兩個基因獨立轉錄，我們假定它們中間存在兩個方向的轉錄啟動子。

(vii) 如果一次刪除造成了轉錄融合，那我們將在兩個基因中間插入一個雙向的終止子。

這個策略被稱為RGD（Reduction Genome design），其實是一個不斷修正的過程。值得一提的是，早期當研究人員沒有遵循這個策略的時候，曾經在刪除一個非必需基因的時候把終止子給漏了，影響了一個必需基因的啟動子，而部分細菌通過自身突變把這個謬誤校正過來了。

根據這個策略，研究人員最後會設計出猜想最小基因組（HMG，hypothetical

minimal genome）。

3.Build 環節

自然的，設計完成之後就是構建。手裡沒貨，想什麼都是白搭。構建流程基本如下：

1.寡核苷酸合成：有機合成DNA與生物合成不同，為了防止副反應的發生，通常需要對不反應基團進行保護。這限制了有機合成DNA的長度，目前的極限為260bp左右。這項研究中寡核苷酸合成的長度為48bp。

2.重疊連接：將寡核苷酸連接成1.4kb的片段。

3.校正。

4.PCR擴增。

5.5X組裝：連接成7kb片段。

6.RCA擴增

7.DNA測序驗證正確性。

8.15X組裝：操作模塊。

9.8X組裝：完整基因組。

4.Test環節：檢測基因組生存力

在這一部分，我們將對移植人工基因組的細胞進行擴增培養，檢驗生存力的強弱，以此判斷基因組設計的效果，便於進一步修改和校正。

最重要的是，在驗證上一輪設計的正確性之後，下一輪刪減的數據準備也將在這一階段進行，包括全域轉座子誘變實驗，進一步完成對基因組的分類和標記，方便後續的基因設計。研究組引入了多級培養以便區分必需基因、類必需基因以及非必需基因。研究組不僅會從移植細胞（P0）中取樣，還會將其培養多代後取樣（一般為P4）。一般地，對基因組檢測結果可能為：

(i) 基因根本沒有被命中，或者只在3』端20%的區域或者5』端開頭幾個鹼基被命中，就被歸類為必需基因（e-genes）。

(ii) 如果P0和P4菌株中都被廣泛命中，則被歸類為非必需基因（n-genes）。

(iii) 在P0中發現命中但在P4中沒有發現，則被歸類為類必需基因（i-genes），它們的刪除會導致細菌生長損傷。根據對細菌生長的損傷程度，從最小到嚴重，還可以劃分出in-genes和ie-genes。

5.模塊化（modularization）

· 分塊

模塊化是設計基因組過程中最重要的思想之一。即使相對於自然基因組，模板基因組已經很小了（syn1.0也不過1000kbp），但整體操作仍然太過笨重，效率低而且容易出錯。因此研究人員對基因組進行了分塊，一共分成了8個片段，每次只改動一個片段，而其它七個片段保持不變，這樣可以控制一個相對固定的背景基因組（background），可以大幅降低工作量。最後每個片段都設計完成後，再統一組裝起來，進行最後的測試。

· 模塊化引入的問題：從syn2.0到syn3.0

這裡要填之前的一個坑：為什麼比較基因組獲得的保守核心與必需基因核心不一定相等？原因可從下面這張圖窺見：

由於必要基因對中的任何一個基因有其替代，所以它們倆都可以「任意浪」，都不保守，但是如果兩個基因同時被敲除，細菌還是會死亡。

可以預見的是，兩個基因在轉座子誘變時都會被轉座子插滿，只是不會同時被插滿。如果沒有引入模塊化，這個問題還可能被注意，但引入模塊化後，就可能發生一個尷尬的局面：兩個基因位於不同的模塊，都被標記為非必需基因然後被刪除了，等到最後組裝的時候——細菌死了。

在syn3.0的設計合成中，這種問題尤其突出，耗費了研究組大量的精力進行篩選。

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四、最終的壓縮成果——JCVI-syn3.0

· JCVI-syn3.0基因組

?基因組大小：531kb

?基因總數：473

?基因產物：438種蛋白質和35種注釋RNA

刪除圖譜：

>>長棕色箭頭代表模塊（兩頭有限制性內切酶Not I位點，連接需要）

>>藍色箭頭代表始終保留的基因。

>>黃色箭頭是最後被刪除的基因。

>>綠色箭頭是開始被刪除後來又被加回來的基因。

>>箭頭方向代表轉錄方向。

· 保持基因的分析歸納

·· 基因表達佔比41%

·· 基因組信息保護佔比7%

·· 膜結構與功能佔比18%

·· 胞質代謝佔比17%

·· 未知佔比17%

· 關於149個未知基因

這種未知其實分為兩類：一類是自上而下地未知，我們知道它的大致功能，但我們還沒有完全確定它的分子機制是什麼；一類是自下而上的未知，我們知道它編碼的蛋白質，但卻不知道它的底物以及參與的代謝通路。

值得一提的是，前者雖然有功能性的分類，但這種分類卻有著簡化的風險。比如細菌的外排系統由6個基因負責編碼，很難想像它們都執行相同的功能。到底是基因中這些功能的確這麼普遍，還是它們本質上是一個全新的過程？這隻能以後慢慢揭示。

總之，未知代表著希望：生命底層架構可能還有我們不曾想像過的機制。

· JCVI-syn3.0的形態報告

細菌具有形態多樣性，一般聚成小的重複單位，這與syn1.0具有相似的生長模式。相對syn1.0，細胞分裂速度減慢了，但仍然遠遠大於天然支原體（天然支原體，16h—>syn3.0，180min）

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五、關於基因組壓縮的進一步實驗

· 重組設計

簡單來說就是打亂順序，調整基因排列順序。實驗結果顯示，基因順序的重排並不怎麼影響生物的生存與分裂。

· 重編碼和RNA替換

前者簡單來說就是進行同源序列的替換——用其它生物的同源基因替換支原體基因。結果顯示支原體生長在一定情況下可以不受影響。

RNA替換研究的就是什麼情況下同源序列替換不會影響生物功能，其主要內容為密碼子變化帶來的影響。由於不同生物對密碼子的青睞程度不一樣，儘管氨基酸序列可能差別不大，但不同密碼子的使用會帶來一定的影響（合成困難，一個原因可能是對應tRNA不足）。

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六、反思 · 壓縮真的到了極限了嗎？

Nanoarchaeum equitans ：基因組大小 0.49

Mbp，540 個基因。比JCVI-syn3.0還要小。或許對於絲狀支原體來說，JCVI-syn3.0已經到達了壓縮極限（再壓縮下去就要以犧牲生長速率為代價了），但它顯然還沒有考慮基因層次的壓縮。同樣的功能蛋白，基因可能可以通過更精簡的序列實現，加上重疊基因的存在，基因編碼效率還有提升的空間，基因組還可以進一步壓縮。人類距離建立從鹼基序列到生物性狀的完整映射還有很長的路要走。

· 壓縮基因組過程中為進一步設計基因組的技術儲備

我們可以用相同的方法構建任何預想中的細胞：比如引入全新的代謝途徑，改變基因編碼方式，或者對基因組進行重排。

·分子生物學之殤：科研搬磚之集大成者

說實話，作為一個生物狗，看完這項研究心情是十分複雜的。儘管現在已經進入後基因組時代，談論生物信息像談論計算機信息一樣自然，但是，生物信息畢竟是搭載在複雜的系統中的。文章中輕描淡寫而過的全域轉座子誘變技術，可能意味著數以萬計的培養基，意味著無數科研人員暗無天日的重複勞動。我們很清楚，將來有一天這些工作會被更簡單的技術代替，但目前，為了向我們理想中的生物高地前進，還是得拾起這些枯燥的操作。

參考文獻：

http://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253?

science.sciencemag.org

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預告：

原來的計劃跳票了（雖然可能沒有人關心）(；′д｀)ゞ

所以文章預告還是沒變......

震驚！毛毛蟲完全變態的起源竟可能是祖先亂交。(￣▽￣)／

感謝閱讀！

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