怎麼改進PCR，可以更好地獲得目的條帶？這裡有答案

古語有云：一入生物坑似海。作為一隻苦逼的實驗狗，我已經對未來沒有什麼太多的希望了，只希望自己能夠老老實實做完實驗，發一篇符合老闆要求的文章，順利畢業後過上閑雲野鶴面朝大海春暖花開說走就走隨心所欲（此處省略一萬字）的幸福生活哈哈哈哈哈········

然而，當我看到我的PCR結果時，我想我一定是瞎了！瞎了！

誰能告訴我，為毛我一個條帶都沒p出來？96孔板毛都沒p出來呢？說好的幸福人生遙遙無期了呢。

然而實驗還是要做的，業還是要畢的。不敢問老闆生怕老闆咆哮的我，只好自己努力爆發小宇宙，發揮畢生絕學，獨立更生的解決我可憐的PCR。

好在經過我不斷地嘗試，我終於get到了PCR的真諦。大家同為生物狗，秉著「奇文共欣賞，疑義相如析」的精神，我來給大家分享一下我的PCR小竅門。

首先我們來回顧一下，PCR的體系是什麼？PCR的過程又是怎樣的呢？1min之內沒想全的朋友們可以自動面壁告別生物界了。體系不外乎是模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，緩衝液，Mg2+還有水，PCR的反應過程就是傳說中的變性、退火和延伸了。好，那麼請問：當我們擴增不出目的條帶，跑膠發現空空如許的時候，我們在想些啥子咧？咳咳，讓我們秉著認真嚴謹的態度來開啟科學的大門吧。

1 模板

畢竟PCR實驗能夠成功的立足之本就是模板。實驗的源頭如果都是錯的，實驗又怎麼可能成功呢？有些模板保存不當，放置時間過長或者已有降解，此時就需要更換模板；有些模板提取時操作手法不夠純熟，導致模板不純，含有taq酶抑製劑或者雜蛋白，此時應該純化模板並重新提取，並且檢測模板是否含有抑製劑。此外，模板的濃度過高或者過低都會對PCR的結果造成影響。PCR的靈敏度很高,用PCR產物或者質粒做模板時,只需要1ng左右,如果用genomic DNA或者cDNA做模板,模板量可適當增加，可以通過對模板進行梯度濃度預實驗，從而確定模板的合適濃度。

2 引物

引物的特異性是非常重要的一點。引物最好在模板的保守區設計，長度在20bp左右均可，GC含量應該小於60%，3』端不能有連續超過三個的G或者C，要避免引物自身形成二聚體。設計完成之後，可以進行引物的BLAST，檢測引物的特異性，或者直接用NCBI的prime blast設計引物，有些引物極易降解，所以要注意冰上操作以及低溫保存。

3 試劑

確保DNA聚合酶活性沒有下降甚至已失活，這一點就需要注意每次用完試劑，要及時放回冰箱，當然，能夠室溫保存幾個月的BenchTop Taq mix 是個例外啦。

4 反應條件

首先是Tm值，Tm值在PCR過程中的重要性無須贅述。Tm值過高，引物難以和模板結合，難以擴出條帶；Tm值過低，則降低了特異性，容易出現雜帶。一般來講，Tm值=4(G+C)+2(A+T)，而PCR時設置的復性溫度=Tm值-(5～10℃)，其中A，T，G，C分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果(G+C)%含量為50%時，則復性溫度可設為55℃。不過如果你覺得加減法浪費了你做實驗為科研獻身的大好時光的話，你訂購引物的公司都會隨引物附贈引物訂購單，上面有你訂購時引物的序列名稱以及Tm值。不過需要注意的是，Tm值-(5～10℃)只是一個經驗值，如果仍然無法擴增成功（因為某些引物的工作溫度會大於Tm值），請一定要！設置溫度梯度！獲得最適的復性溫度之後，再投身到科學的海洋之中。。。。

其次，設置PCR程序時，一定要設置合適的延伸時間。一般taq酶的延伸時間是1kb/min，根據擴增產物的長度設置足夠的延伸時間，如果延伸時間不足，DNA聚合酶還在模板上兢兢業業的擴增時，突然溫度驟升，DNA雙鏈打開，開始變性。。。。導致雜帶增多，你以為是雜帶，實際都是不完整的目的條帶。

5 反應體系

反應體系是可以進行優化的哦。比如Mg2+，Mg2+影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性。最佳的鎂離子濃度對於不同的引物對和模板都不同，在多數情況下，較高的遊離鎂離子濃度可以增加產量，但也會增加非特異性擴增。為了確定最佳濃度, 可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進行預實驗,選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質,以保證最適Mg2+濃度。

此外，江湖上還流傳著一種叫做PCR添加劑的傳奇物質，包括甲醯胺，DMSO，甘油，甜菜鹼等，常用的是DMSO和甘油。它們的機理是降低熔解溫度，從而有助於引物退火併輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區。甘油和DMSO的作用是一樣的：降低雙鏈的結合力量，減少非特異的產生。但是，不同的PCR反應體系，添加劑發揮作用的濃度是不一樣。所以，如果使用PCR添加劑，需要對濃度梯度進行優化。加入量太少，添加劑不發揮有效的作用。加入量太多，添加劑會影響甚至抑制PCR的擴增。甘油和DMSO不必同時加,加5%的甘油或者10%的DMSO即可。如果該濃度仍然不work，那麼可以選擇設置梯度，畢竟不同的實驗條件對應了不同的實驗體系，實驗也並非一成不變，常常需要我們根據具體情況具體分析，才能得到一個滿意的結果。

當我們從這幾個方面對PCR進行改進的時候，基本上就可以得到我們的目的條帶了。作為實驗狗，我深深的明白實驗本身充滿了不確定性，而我們能夠做的就是排除不確定因素，摸索出最適合的反應體系和反應條件，雖然在此過程中充滿了各種失敗的心酸和老闆的咆哮。畢竟古語又雲了，路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索。

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