高通量測序技術應用

04-27

摘要：高通量測序技術(High-throughput

sequencing)又稱「下一代」測序技術("Next-generation"sequencing technology)，以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標誌。同時，高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細緻全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)

一、測序技術發展現狀

　　根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序(MassivelyParallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454 pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序(Ion

semiconductor sequencing)、DNA納米球測序 (DNA nanoballsequencing)等。

　　隨著第二代測序技術的迅猛發展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序(de novosequencing)，獲得該物種的參考序列，為後續研究和分子育種奠定基礎;對有參考序列的物種，進行全基因組重測序(resequencing)，在全基因組水平上掃描並檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行全轉錄組測序(wholetranscriptome resequencing)，從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)等研究;或者進行小分子RNA測序(small RNAsequencing)，通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發現新的microRNA分子。在轉錄組水平上，與染色質免疫共沉澱(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉澱(MeDIP)技術相結合，從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。

　　二、高通量測序技術的應用

　　測序技術推進科學研究的發展。隨著第二代測序技術的迅猛發展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序(de novosequencing)，獲得該物種的參考序列，為後續研究和分子育種奠定基礎;對有參考序列的物種，進行全基因組重測序(resequencing)，在全基因組水平上掃描並檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行全轉錄組測序(whole transcriptomeresequencing)，從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)等研究;或者進行小分子RNA測序(small RNA sequencing)，通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發現新的microRNA分子。在轉錄組水平上，與染色質免疫共沉澱(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉澱(MeDIP)技術相結合，從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。

　　需要特別指出的是第二代測序結合微陣列技術而衍生出來的應用--目標序列捕獲測序技術(Targeted Resequencing)。這項技術首先利用微陣列技術合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區域互補結合，從而富集到特定區段，然後用第二代測序技術對這些區段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen，應用最多的是人全外顯子組捕獲測序。科學家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數據分析計算量較小，與生物學表型結合更為直接。

　　目前，高通量測序開始廣泛應用於尋找疾病的候選基因上。內梅亨大學的研究人員使用這種方法鑒定出Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel-Giedion綜合征是一種導致嚴重的智力缺陷、腫瘤高發以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用AgilentSureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt，每個個體產生了2.7-3GB可作圖的序列數據。他們聚焦於全部四位患者都攜帶變異體的12個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫學院基因組測序中心也計劃對15種以上疾病進行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉症以及其他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結束的Science雜誌年度十大科學突破評選中，外顯子組測序名列其中。

　　三、測序技術總結與展望

　　第一代測序技術憑藉其長的序列片段和高的準確率，適合對新物種進行基因組長距框架的搭建以及後期GAP填補，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結構，但是在判斷連續單鹼基重複區時準確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價位低的特點，可以用於大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-end sequencing)可以為基因組進一步拼接提供定位信息，但是隨著反應輪數增加，序列長度和質量均有所下降，而且在閱讀AT區時有明顯錯誤傾向。SOLiD基於雙鹼基編碼系統的糾錯能力以及較高的測序通量，適合轉錄本研究以及比較基因組學特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術在基因組拼接中的廣泛應用。第三代測序技術目前正在研發階段，尚未正式投入使用。

　　參考文獻：

　　論文《新一代測序技術的發展及應用前景》，中山大學生科院，《生物技術通報》2010年第10期

　　論文《新一代高通量測序技術臨床應用前景》，《廣東醫學》，2010

　　論文《高通量測序技術及其在微生物研究中的應用》，《微生物學報》，2011.04

　　綜述《新一代測序-高通量技術》，生物谷，2010，03

高通量測序：https://www.genewiz.com.cn/Public/Services/Next-Generation-Sequencing