CHO細胞的江湖

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作者簡介

韓向宗，博士，默克生物工藝部門上游研發中國區負責人，負責細胞株開發、定製化培養基開發及過程工藝開發，涵蓋大分子生物製造和疫苗行業。韓博士在生物製造行業有超過15年的從業經驗，特別是在基於CHO細胞的重組蛋白表達平台擁有豐富的經驗。在加入默克之前，韓博士在中國第一家專註於生物製藥的CRO公司中美奧達任上游研發總監，並領導了數十個項目的開發。韓博士畢業於山東大學生命科學系，之後在中國科學院上海生命科學院獲得生物醫藥博士學位。

哺乳動物細胞具有和人類相似的複雜翻譯後修飾，常被用來表達具有活性的生物大分子蛋白。而這些生物大分子的功能發揮在一定程度上依賴於這些翻譯後修飾。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等細胞均被研究並用作生物大分子蛋白的表達，但是有近70%已經上市的治療性蛋白是由CHO細胞表達生產的，CHO細胞已經成為需要複雜翻譯後修飾的治療性蛋白生產的主要工具。這主要得益於CHO細胞的以下一些特點：1）具有和人類似的翻譯後修飾；2）清晰的歷史背景和監管機構的認可；3）較少的分泌性內源蛋白；4）在無血清及化學限定培養基中快速穩健的懸浮生長；5）病毒安全性; 6) 四十多年來積累的知識和經驗。隨著近些年在細胞工程及細胞培養基以及工藝開發方面的顯著進展，CHO細胞的表達量獲得了非常顯著的提高，超過10g/L的流加培養工藝及25g/L的濃縮灌流培養工藝常見於學術期刊和會議報告。

CHO歷史及種類

CHO細胞最早由Puck實驗室在1957年分離，通過將0.1g中國倉鼠卵巢組織酶解消化獲得。酶解後大部分細胞屬於成纖維細胞，在進行超過10個月的體外培養後，細胞並未表現出普通二倍體細胞的Hayflick界限，仍然可以繼續分裂生長，但是細胞形態從最初的成纖維細胞轉變成近上皮細胞的形態。1958年Puke實驗室將此連續傳代細胞進行重新克隆後，建立了我們現在所用的CHO細胞最原始細胞系。這個最原始的CHO細胞系是脯氨酸缺陷型的，必須在培養基中添加額外的脯氨酸以支持其生長，目前所有已知的CHO細胞系均保留了這個特性。這個最原始的CHO細胞系後來流轉到不同的實驗室和公司，經過不同的培養、馴化、改造和重新克隆後形成了不同種類的CHO細胞系。這些細胞系雖然都是來源於最原始的CHO細胞系，但由於CHO細胞基因組內在的不穩定性及後續不同實驗室的篩選培養條件不同，不同CHO細胞系之間的形態、生長、表達、代謝、甚至基因組都有較大差異，下面就幾種常用的CHO細胞系進行描述。

CHO-K1

CHO-K1是未經改造的野生型CHO細胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的實驗室將原始CHO細胞系的一個亞克隆存放於ATCC（CCL-61），並命名。隨後源於ATCC CHO-K1的一個亞克隆在1985年被分離，並保存於ECACC（85051005），並被製藥公司和CMO公司用作重組蛋白的表達。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養，並需要添加血清，由於血清的批間穩定性問題，及後來病毒安全性問題，無血清懸浮培養成為趨勢。其中Lonza公司從ECACC獲得CHO-K1馴化到懸浮無血清培養後，建立CHO K1 SV（Lonza，2002）細胞株，並廣泛應用於其GS表達平台。Merck（原SAFC）也是從ECACC獲得CHO-K1細胞株，並懸浮馴化至化學成分限定培養基中，形成了CHOZN? CHO K1（Merck，2006）細胞株。

基於CHO-K1細胞的表達平台多採用GS（谷氨醯胺合成酶）篩選系統和/或抗生素篩選系統。採用GS篩選系統的平台可在轉入目的蛋白基因的同時轉入GS基因，在篩選階段採用不含谷氨醯胺的培養基進行篩選。但由於CHO-K1細胞具有內源的GS基因，因此在篩選時往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同時篩選，以提高篩選效率。此外，由於內源GS基因的存在，篩選出的高表達克隆往往穩定性較差，需要進行充分的穩定性評估後，方可用於後期的工藝開發及規模化生產。而單獨採用抗生素進行篩選的平台，因篩選效率較低，多用於研究階段。目前多個已經上市的治療性蛋白是基於CHO-K1細胞進行開發生產的。

CHO-S

基於原始的CHO細胞系，1973年Thompson實驗室分離了一株可用於懸浮培養的CHO細胞，並將此細胞命名為CHO-S。雖然都來源於最原始的CHO細胞系，但從細胞歷史分枝上看，CHO-S和CHO-K1分屬於不同的代系。此細胞系在1980年代後期提供給當時的Gibco公司，後者將此細胞馴化至CD CHO培養基中，建庫並以CHO-S名稱進行推廣。因其能在無血清培養基中懸浮生長，並支持高密度培養，在早期常被用作瞬時表達宿主細胞。此後，相應的GMP細胞庫被建立，並支持商業化授權開發。

CHO-DXB11

CHO-DXB11（又名DUK-XB11）是由哥倫比亞大學的Urlaub和Chasin在1970-80年代通過伽馬射線誘變的方法獲得。CHO-DXB11細胞的雙等位基因中，一個DHFR基因被敲除，另一個DHFR基因僅包含一個錯義突變（T137R），這使得此細胞不能有效還原葉酸而合成次黃嘌呤（H）和胸苷（T）。在表達外源重組蛋白時，將外源的DHFR基因和目標蛋白基因同時轉染細胞，並通過缺乏HT的培養基進行篩選。由於DHFR基因可以通過重組重排進行基因擴增，在適當的MTX壓力下，可以通過DHFR基因的擴增同時獲得目標蛋白基因的擴增，從而獲得更高表達的穩定表達細胞株。在早期CHO細胞培養時通常需要加入血清，因此在當時的細胞篩選protocol裡面經常會看到用透析血清來避免引入HT或其它核酸代謝底物。此外需要指出的是，CHO細胞平台上第一個被批准上市的tPA就是採用DXB11做為宿主細胞，並且此宿主細胞被Genentech用於後續的多個商業化產品生產。

CHO-DG44

由於DXB11細胞中僅有一個等位基因被敲除，在長期傳代過程中，會發生低幾率的突變使宿主細胞重新恢復DHFR基因活性，造成篩選壓力的下降甚至導致重組蛋白表達量的下降。因此，獲得一個雙等位DHFR基因完全敲除的宿主細胞成為一個需求。Chasin實驗室先後通過化學誘變和伽馬射線誘變，最終在1983年篩選出了雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細胞，並命名為CHO-DG44。雖然和DXB11都屬於DHFR基因缺陷型，但從譜系分枝來看，DG44和CHO-S更為接近。因為DG44細胞完全缺失了DHFR基因的活性，並且可以無血清懸浮培養，使得篩選和加壓過程變得更加有效。目前多家公司及CDMO企業採用此細胞做為平台進行治療性蛋白的開發，已經有多個產品進入臨床及上市階段。

CHOK1SV GS-KO

Lonza在其CHOK1SV細胞的基礎上，與Cellectis 合作並利用後者的Meganucleases技術將CHOK1SV細胞中GS的雙等位基因完全敲除，於2012年推出了CHOK1SV GS-KO細胞株。由於內源性的GS基因被完全敲除，大大提高了篩選效率，縮短了穩定細胞株的開發周期（相比CHOK1SV系統縮短了6周），同時提升了最終克隆的穩定性。基於GS-KO細胞的GS Xceed表達平台除包括宿主細胞株外，還包括相應的質粒及V8培養基系統。GS Xceed已經在全球用於多個產品的開發，並向全球授權（Lonza一代CHOK1SV不給中國授權）。但由於V8培養基系統相對複雜，多數CHOK1SV/GS-KO客戶並未採用其培養基系統。

CHOZN GS

Merck（原SAFC）於2006年通過ECACC獲得CHO-K1細胞株，並將其馴化至化學成分限定培養基CD Fusion中，然後進行亞克隆建立CHOZN CHO K1細胞系。在此細胞系基礎上，通過ZFN（鋅指核酸酶）技術敲除GS雙等位基因，獲得GS缺陷型細胞株CHOZN GS，並於2012年推向市場。整個平台除細胞株外，還包括質粒、克隆構建階段用的培養基及流加工藝平台培養基。通過平台化的培養工藝進行細胞篩選，可將穩定細胞株構建及上游工藝開發周期縮減到18個星期。目前以CHOZN GS做為宿主細胞的多個項目已經在全球多個國家推進到臨床實驗階段。

Others

除了上述在工業界應用較多的細胞系外 ，還有其他一些CHO細胞系也在應用。

如在歐洲應用比較多的Selexis公司SURE CHO-M細胞株，其源於ECACC CHO-K1細胞系，並經馴化後獲得，Selexis表達平台同時運用MARs元件來提升篩選效率和目標蛋白表達量，運用CHO-M的多個項目已經推進到臨床實驗階段並有一個分子獲得批准上市。

Horizon的HD-BIOP1（GS Null CHO-K1）也是源於ECACC CHO-K1細胞系，通過rAAV技術將雙等位GS基因敲除，獲得GS缺陷型細胞，但由於基因編輯實驗過程中部分實驗關鍵材料記錄不全而引起監管機構的擔心，Horizon試圖通過全基因組測序來消除監管機構的擔心，但由於基因組數據過於龐大以及現在對整個基因組數據的解讀尚需時日，目前為止尚未在歐美國家獲得臨床實驗批准。

儘管可以通過不同途徑獲得CHO細胞用於研究，特別是在科研院所不同實驗室之間的交流時常發生，但最終如果想走向商業化應用，就要求所採用的宿主細胞必須有清晰的歷史背景信息，並且儘可能的確保記錄所有傳代培養過程中採用的關鍵原材料信息，以確保細胞株的安全性。特別是當前對生命科學的了解還相當有限，即便是對於轉基因食品，包括專業人士在內的不同群體之間尚且爭論不斷，因此背景清晰且有成功進入臨床或上市產品作為參考的宿主細胞更容易獲得監管機構的認可。

此外需要注意的是，儘管在研發階段很多細胞株可以免費（或極低費用）使用，但一旦需要進入商業化（臨床實驗）階段，均需要支付商業化生產許可費用。下表列舉了部分細胞株的研發及商業化授權費用模式供參考。

基因工程改造

雖然CHO細胞相對其他幾種哺乳動物細胞有諸多優點，但工業界對CHO細胞更高性能的追求從未停止。目前常用的CHO細胞尚存在一些缺陷，比如：

· 較長的穩定細胞株構建周期(4+月)；

· 較低的產量(<10g/L)，造成單位生產成本較高；

· 較長的細胞倍增時間(20+小時)；

· 多種宿主蛋白對下游純化造成壓力；

· 遺傳學的不穩定性，造成細胞表達量隨著培養時間的延長而降低；

· 克隆內部的異質性；

· 蛋白質量(PQAs)的異質性;

這些問題的解決大多需要細胞工程學研究來解決。如通過鑒定細胞基因組中的「熱點」區域，並通過定點整合技術將目標基因定點整合到基因組中，進一步縮短細胞株構建周期；通過優化細胞代謝通路，提升代謝效率，提升細胞倍增速率；產量的進一步提升可以通過過表達一些蛋白摺疊輔助蛋白等來實現；敲除對細胞生長和蛋白分泌不相關的一些蛋白基因，可降低宿主細胞壓力，同時減少宿主蛋白對下游純化的干擾；蛋白翻譯後修飾在大分子藥效葯代過程中扮演著重要的角色，通過基因工程可以修改這些修飾相關酶的表達量，來調控翻譯後修飾。

目前已經研究的一些靶點如上圖所示，其中一些靶點已經被應用到工程CHO細胞的改造。但如果計劃將這些改造應用於商業化目的，就需要了解這些改造所牽涉到的靶點，及改造過程中所應用的技術背後的知識產權問題。

結語

細胞株在整個生物製造工藝中有著至關重要的地位，一株高產、穩定的細胞株不僅使得上游生產工藝變得簡單，同時還可能有利於降低下游生產工藝的複雜度及整個生產工藝的成本。因此各大製藥公司均對細胞株的選用及穩定細胞株構建非常重視，而最終獲得的高產穩定細胞株又是每一個在研產品的核心資產。中國目前還處在生物製藥行業的快速起步時期，有大量的人力財力投入到這場轟轟烈烈的開發進程中，但早期對宿主細胞株的選擇和來源並未受到應有的重視，致使許多項目在開發的後期才發現宿主細胞的背景信息不全面而影響項目進度，甚至不得不重新開發，即便有些公司採取了一定的彌補手段，使得項目得以繼續推進，但同時也為整個項目埋下了很大的隱患。最近兩年，隨著行業的逐步成熟，大家開始普遍重視對宿主細胞的選擇，除了要求有清晰的歷史背景信息外，在選擇時還要考慮研發周期、成本以及後期整體的生產成本。

參考文獻

1. G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers, L.A. Chasin (1983), 「Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells」, Cell, 33, pp. 405-412

2. Hauser, H. and R. Wagner (2014). Animal Cell Biotechnology: In Biologics Production

3. Fischer, S., R. Handrick and K. Otte (2015). 「The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.」 Biotechnol Adv 33(8): 1878-1896.

原文首發於：華人抗體協會微信公眾號（chinese_antibody）

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