BioFire公司的FilmArray晶元的檢測流程
第五部分 晶元的檢測流程
在講述晶元的檢測流程之前，需要先講述一下晶元內部液體的驅動力，和離心驅動，泵驅動等方式不同，FilmArray採用一種全新的氣動囊泡結構來驅動，姑且將其命名為氣動擠壓驅動。
在儀器內部具有和FilmArray測試晶元中柔性袋各反應池一一對應的囊泡結構，可以想像，對某些囊泡進行充氣，則囊泡會擠壓柔性袋特定部位，從而使得該部位的液體流向其他未擠壓部位，同理，如果對某個關鍵通道處進行充氣擠壓，則會完全封閉該液體通道，放氣則會使得通道打開，如此便形成了該柔性袋中的擠壓閥。這種囊泡結構的氣動擠壓促使液體均勻可控的朝向下一個反應池運動，同時由於擠壓閥的存在，液體在柔性袋中的流動方向和流動體積則變得完全可控。
下圖是儀器中與柔性袋對應的囊泡結構，通過對這些囊泡結構的充氣和放氣，便可以控制液體在各反應池中運動，完成例如細胞裂解，核酸純化，巢式PCR擴增等基本反應。
圖5.1：FilmArray儀器中用於擠壓柔性袋的囊狀結構示意圖。
下圖是FilmArray測試儀器的內部結構圖，可以看出，整個儀器都是使用壓縮氣體來驅動的，而壓縮氣體上的閥門，以及哪一個部位應該充氣或放氣，則是由電腦程序來精確控制
圖5.2：FilmArray檢測儀器內部結構圖。
1，晶元準備
測試晶元通過真空的方式吸入待測樣品和稀釋液，如下圖為採用注液底座的方式向測試晶元中加入試劑的過程示意圖。
圖5.3：檢測晶元放入儀器之前的準備過程。
首先將該測試晶元插入到注液底座中，再使用具有鈍頭金屬套管的注射器從紅色（可能為血液樣品）試管中吸取一定量的試劑，插入到測試晶元的樣品入口處，晶元的試劑入口處的隔膜會破裂，內部真空環境會吸取注射器內部的液體試劑，待測樣品（其中含有比如鼻咽抽出液NPA或鼻咽拭子NPS的病毒轉染培養液）通過樣品注入口加入到晶元內部。同樣的可以將稀釋液注入到晶元內部。整個手工操作只需要2分鐘。
圖5.4：檢測晶元加入血樣和試劑後放入儀器中的過程。
用與儀器相連的手持掃碼器掃描晶元表面的二維碼，識別該晶元的種類，保質期，樣品種類等等信息，然後將裝載有試劑的晶元插入到FilmArray儀器中，剩下的工作就交由儀器全自動完成。
2，樣品裂解
在儲液管1中預裝有凍乾的裂殖酵母作為過程式控制制，樣品進入儲液管1後會溶解裂殖酵母。如下圖所示。一旦樣品進入，立即啟動儀器中的擠壓閥16關閉樣品通道14，由於擠壓閥16和36都處於關閉狀態，故該細胞裂解區處於臨時封閉狀態。在此處，通過位於細胞裂解區對應的囊泡結構的充氣和放氣，可以實現擠壓液體進入或流出某個腔室，混合液的快速流動和撞擊會導致研磨珠研磨溶液中的細菌細胞或病毒，使得細胞破裂而釋放出核酸物質。研磨完成後，打開擠壓閥36，擠壓24,26,28三個區域使得裂解液進入核酸純化區。
圖5.5：柔性袋中細胞裂解區內部結構及其功能
圖5.5：儀器內部與細胞裂解區對應的充氣囊泡結構
3，核酸純化
如下圖為專利US8409508中公開的核酸純化區的基本結構。（也可以採用其他類似結構。）
圖5.6：柔性袋中核酸純化區的結構
從裂解液中純化核酸和普通實驗室中所用的磁珠法回收DNA的基本原理是一致的，大致可以分為核酸結合-清洗雜質-核酸洗脫的步驟：
1-核酸結合：裂解液進入核酸結合池44後，裂解液中的核酸會和預裝在該池中的硅膠磁珠結合，打開擠壓閥53，通過氣壓囊泡反覆擠壓核酸結合池44和磁珠回收池58，使得裂解液和磁珠在這兩個池之間來回震蕩混合，核酸被磁珠充分吸附，然後用儀器中的可伸縮磁鐵回收磁珠。
2-清洗雜質：關閉擠壓閥53,打開55.使用清洗液池中預裝（也可以預裝到儲液管中而非清洗液池處）的乙醇,異丙醇或其他有機試劑清洗回收池58中的磁珠，此清洗過程也會在兩個池之間震蕩幾次使得清洗充分。
3-核酸洗脫：同樣，關閉閥門55，打開57，使用預裝的水或其他洗脫劑來洗脫吸附在磁珠上的核酸，同樣，使用囊泡結構擠壓兩個池使得洗脫液在兩個池之間來回震蕩，達到充分洗脫核酸的目的。如下為核酸純化過程示意圖。
圖5.7 柔性袋中核酸純化區進行核酸提純的步驟說明
4，PCR-I反應及模板稀釋
純化之後的核酸則進入到第一擴增區進行逆轉錄或者PCR-I反應。該核酸擴增區的結構可以採用不同的形式，以下是專利US8940526中公開的一種結構形式，該結構可以同時進行PCR-I反應和擴增產物的稀釋。此稀釋步驟的主要作用是可以極大的消除原始宿主的模板DNA及PCR-I反應液對第二PCR的影響。如下所示。
圖5.8：柔性袋中第一擴增區結構示意圖
當純化核酸進入PCR-I擴增池61後，關閉擠壓閥52和72，使得該PCR-I擴增池處於暫時封閉的狀態。PCR-I所需的反應試劑，包括DNA聚合酶，dNTPs，緩衝液等都可以通過儲液管加入到61中，也可以通過點樣預固定在61中。通過儀器上與61對應的加熱板則可以進行溫度的循環控制，從而實現PCR反應。
PCR-I反應完成後的擴增子需要進行稀釋後才能用於PCR-II反應。此處擴增子的稀釋是在擠壓閥72，過渡池70，71和稀釋液池62-66的共同作用下完成。該結構可以進行三步稀釋法，第一步稀釋：打開擠壓閥72，PCR-I擴增池61中的擴增子與稀釋液池62中的稀釋液發生混合。稀釋的倍數由擴增池61和稀釋液池62的體積比來決定。第二步稀釋：第一步的稀釋液進入過渡池70後，與63和64中的稀釋液發生混合。同理，此時的稀釋倍數由過渡池70與63和64的體積比決定。同理進行第三步稀釋。稀釋後的模板通過通道78進入到PCR-II擴增區。
PCR-I擴增區和稀釋區的結構也可以採用其他形式，比如下圖中結構，
圖5.9：另外一種形式的第一擴增區結構。
在稀釋完成之後，需要對稀釋池進行加熱處理，這是PCR-II的熱啟動，為PCR-II做準備。
5，PCR-II反應
PCR-II的反應過程發生在熱啟動之後，如下圖所示，該擴增區具有多個反應微池陣列，以及覆蓋在微池進入通道上的擠壓閥。當PCR-II反應液和模板都進入到微池後，關閉擠壓閥，使得每個微池均處於封閉狀態。
每個微池中通過點樣預固定有PCR-II所需引物，每個微池中的引物可以相同，也可以不同，以此可以實現對不同模板上的不同區域進行擴增，從而實現多種病原菌的同時檢測。大約每個PCR循環後檢測微池中的熒光強度獲取傳統RT-PCR擴增曲線。
由於PCR-II反應後不需要將反應產物轉移到其他部位，故第二擴增區的結構不需要柔性材料製備，其他剛性的塑料材質也可以。
圖5.10：柔性袋中第二擴增區的一個示例結構。
6，擴增子裂解分析
在最終的PCR反應完成之後，將樣品置於63度5s，然後將溫度從68度升到95度，使得PCR-II獲得的擴增產物發生高溫裂解，每秒獲取10次熒光強度信號，獲取裂解曲線，即各溫度下對應的每個微池中的熒光強度平均值組成的曲線。
在PCR-II過程中，也獲取了RT-PCR反應中的傳統擴增曲線，很多其他分子診斷儀器都是對該擴增曲線進行分析而得出檢測結果。但是，FilmArray並沒有使用該擴增曲線，而是採用了多級報告機制，採用了裂解曲線進行分析，第一級是單個微池，第二級是單個測試（當反應陣列中多個微池都是特定相同引物時），第三級是單個有機體。這種分析首先在過程對照實驗中進行（即裂殖酵母的核酸分析），如果過程對照實驗顯示為陽性結果，則表示儀器操作和內部生化反應過程正常，再進行待測病原菌分析，報告其結果。如果過程對照實驗顯示為陰性結果，表明儀器或內部生化反應測試失敗，此次測試會被認為無效且不會報告本次檢測結果。
圖5.11：每一個微池中固定不同的PCR-II引物後可以單獨檢測特定的病原菌。
對裂解曲線進行分析並得出是否感染的結果是FilmArray測試晶元相對於其他分子診斷儀器的不同之處。如下圖為兩個來自不同靶標的獨特擴增產物的裂解曲線，以及對該裂解曲線進行負導數求解後的曲線圖。
圖5.12：具有不同Tm值的擴增產物其裂解曲線形狀不一樣。
由於PCR-II是對不同病原菌進行DNA擴增，故PCR-II擴增出來產物的長度和序列不同，該擴增產物的熔解溫度Tm也會不同。在發生裂解反應時，當溫度升高到擴增產物的Tm附近時，擴增產物會發生高溫變性，其熒光信號也會發生急劇降低，不同Tm的擴增產物具有不同形狀的裂解曲線，如上圖所示，對該裂解曲線進行負導數求解分析和Tm溫度分析等，將分析結果和軟體中資料庫的標準數據進行比對就可以很容易分辨出DNA所屬的病原菌種類，進而儀器會報告對於某種病原菌是否發生感染，檢測結果是「陽性」還是「陰性」。
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