中藥現代化的策略淺析——以青蒿素合成為例（中）（喵201）
書接上回。
孤星客：中藥現代化的策略淺析——以青蒿素合成為例（上）（喵201）
上一篇專欄文章講到了：在青蒿素的合成中，FPP這個基礎代謝途徑主要跟選擇的底盤有關，不同底盤中我們通過不同的方法來改良這項基礎代謝——而在後續的從FPP轉化為紫穗槐二烯再到青蒿酸的過程，則是現在已經研究明確的從青蒿中分離出的各種酶可以實現的，因此，我們延伸到了在大腸桿菌中FPP的合成，研究解決了內源DXP途徑效率低、外源MVA途徑與自身代謝出現衝突的問題，最終轉入一系列源自植物的酶元件，得到了1g/L的青蒿酸產量。
值得注意的是，在大腸桿菌的研究中使用的AMO和CPR酶，均為CYP71AV1被發現之前的酶元件，當鑒定CYP71AV1後，使用AMO和CPR產生1g/L青蒿酸的效率顯然無法滿足需求，但是，大腸桿菌又無法表達真核生物的P450酶，那麼，利用酵母中原有的FPP，轉入後續途徑，能否得到高產青蒿酸的菌株呢？
結果是，酵母中只產生了100mg/L的青蒿酸，因為其內源途徑的限制，紫穗槐二烯在酵母中只有150mg/L的產量，遠遠低於大腸桿菌的25g/L。
因此，在大腸桿菌中生產紫穗槐二烯，而後轉移到酵母菌中進行二次發酵似乎成了唯一的選擇，但是，二次發酵在成本上會大大提高（多了一次分離純化的成本），為了降低成本，研究人員開始研究如何提高酵母生物合成青蒿酸的產量。
在前面的研究中，研究人員使用的是S288C這種已經測序但是發酵能力低的菌株，因此，使用發酵能力更強的菌株顯然是可能的解決方案。
在用適宜工業發酵的CEN.PK2代替了S288C後，研究人員發現了新的問題——CEN.PK2在發酵時過表達UPC2-1積累乙酸，抑制了細胞的生長。
顯然，這個時候去探究UPC2-1對乙酸積累影響的機制是不合時宜的，此時直接過表達甲羥戊酸途徑的每一個酶即可。
同時，研究人員還用葡萄糖代替了半乳糖作為發酵的碳源，並優化了發酵過程，最終使紫穗槐二烯的產量達到了40g/L。
在紫穗槐二烯的產量提高後，研究人員發現，其青蒿酸的產量並沒有提高，也就是說還在紫穗槐二烯到青蒿酸的氧化還原過程中，還有著抑制產量提高的機制。
進一步研究發現，青蒿酸的產生顯著降低了細胞的生存能力，對比S288C，發現在青蒿酸產生的同時伴隨著編碼轉運蛋白的基因的高水平誘導表達——這裡劃重點：正因為S288C是測序的生物，所以我們能通過組學簡便地分析其基因表達的情況，而對於CEN.PK2則是做不到的！
（在這裡測序底盤的重要性就顯現出來了，一個遺傳背景非常清晰的底盤是很重要的，在此之上我們還可以追求基因組低冗餘的底盤，甚至是只保留必需基因的底盤——我們已經做出了這樣的大腸桿菌底盤。）
研究者們發現，表達CYP71AV1的酵母細胞面臨著嚴重的氧化應激反應，於是，將其對應的還原酶CPR1也導入酵母細胞——細胞生存能力提高但青蒿酸產量下降。
於是，研究者們又轉入了細胞色素b5的基因，細胞色素b5可以提高CYP71AV1的活性，進而提高了產量。
來看一個截止到目前，對酵母底盤進行的改造：
如你所料，又出現了問題。
在成功提高CYP71AV1的活性後，產生了大量的青蒿醛積累，於是，結合上一章所說的那兩個酶：ADH1、ALDH1，青蒿酸產量成功達到目標的25g/L。
研究至此告一段落，25g/L的青蒿酸產量已經滿足了工業生產的需求。
讓我們來回顧一下，青蒿酸生物合成中遇到的問題。
- 選定合適的酶系，由大腸桿菌中的AMO和CPR酶改進為CYP71AV1等；
- 根據酶系和底物選擇表達的底盤，使用酵母來表達真核細胞的細胞色素氧化酶；
- 重構代謝途徑，從多個物種中選取效率最高的酶（大腸桿菌底盤中引入了金黃色葡萄球菌的酶）；
- 代謝產物積累對細胞的影響——要麼快速度過這個化合物的階段，要麼轉運蛋白，要麼繞過這個化合物；
下一章將解析在煙草底盤中的研究——植物底盤在代謝工程中應用的優勢及弱勢。
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