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基因療法結合細胞組織工程技術促半月板損傷癒合

04-22

概述

半月板損傷是骨科手術和運動醫學中常見的問題，半月板損傷或喪失加速了膝關節炎（OA）的發作。儘管臨床醫學已有各種各樣的治療方案，但結合基因、細胞和組織工程的方法是一種很有吸引力的策略，可以產生新的有效的治療方法來治療半月板損傷。本文概述了目前可用於改善半月板修復的工具，並討論未來可能的轉化進展和挑戰。

半月板修復原理

半月板和半月板的結構和功能

半月板是一種半獨立的纖維軟骨結構。它能傳遞關節力量，增加關節穩定性，促進關節營養，為關節軟骨提供潤滑，促進膝關節本體感受的作用（如圖1）。I型膠原蛋白是半月細胞外基質（ECM）的主要膠原蛋白。膠原組織是半月板機械功能的重要組成部分，以周向定向束環繞C型結構，使載荷朝著這個方向有效地轉移。另外，在這個環形網路中穿插著放射狀的「領帶」纖維，並將這個主要的膠原組織結合在一起。半月板的其他成分主要包括蛋白聚糖和糖蛋白。蛋白聚糖的主要作用是保持水（約佔其總重量的65%-75%）在半月板組織中。大分子ECM和水之間的相互作用使得半月板的重要粘彈性特性得以實現。

圖 1 （A）正常的人類左側半月板附在脛骨內側的內側半月板。半月板的半月形身體（MB）和前（AMH）和后角（PMH）被半月形根固定在脛骨髁間區域。內側半月板的前根（AR）插入到前髁部區域，而其後根（PR）則插入脛骨的後內側髁間。內側脛骨（MTP-C）的中心部分不被半月板覆蓋。徑向定向力是由箭頭表示的。比例:1厘米。

（B）通過將內側半月板拉向右側的內側半月板，並將內側半月板插入到前髁部區域。顯示了內側半月板（AMH）前角的脛骨方面。前脛骨平台（MTP-P）的外圍部分現在已經暴露出來，再加上內側脛骨平台的中心部分（MTP-C）。比例:0.5厘米。

半月板的內部（中心）部分主要由纖維軟骨細胞組成，含有較高比例的II型膠原蛋白和蛋白聚糖，而外（周邊）區域包含更多的纖維化細胞，包含I型膠原蛋白和較低的蛋白聚糖含量。由膝狀動脈分支產生的半月性血管供應被限制在半月板組織的周圍10%-25%。如果在這個「紅區」有一個小裂口，自然修復就會發生。神經纖維大多遵循這些血管，半月板的兩個角是最神經支配的。半月板的中心（內）三分之一，稱為「白區」，是無血管的，沒有神經供應。因此，在這一區域，沒有自發的損傷癒合，儘管可能嘗試進行半月的修復（例如，與前十字韌帶撕裂的重建）也在中間的紅白或白白區應用新的縫合技術和/或合成代謝因子。

半月板的根有四個韌帶結構牢牢地固定在脛骨的前和后角上。內側半月板對內側附屬韌帶的堅固連接是它在關節運動中移動能力下降的原因與側半月板相比，它不依附於側旁韌帶也不連接在腘肌肌腱斷裂部位的關節囊。

在膝關節的作用下，半月板扮演著重要的生物力學角色，為膝關節的一致性、負載分布和穩定性做出了貢獻。重要的是，創傷或退化後半月板的損傷與關節功能的改變有關，這通常會導致漸進的關節退化。半月板的重要生物力學功能是由它們的幾何形狀、附件以及組織獨特的力學特性提供的。在關節內的半月板的幾何和物理連線提供了重要的約束條件，控制了半月板對應用力的整體力學響應和運動，並在日常生活活動中為脛股關節的複雜運動學提供了條件。

由於半月板的獨特幾何形狀，膝關節的負重產生了垂直的和輻射導向的力分量，而這往往是向外轉移的。然而，半月板的附件抑制了這種位移，產生了一個巨大的環向力，並在組織內產生了相應的張力「箍應力」。在正常的生理負荷下，半月板（和半月板中的細胞）經歷了一個複雜的機械環境，包括大的拉伸、壓縮和剪切應力。膝蓋內側和外側的股脛間隔室之間存在顯著的結構差異，包括脛骨平台和半月板。

半月板損傷

半月板創傷可以是撕裂損傷或者是與年齡相關的退化變化的結果。半月板撕裂形狀包括放射狀、縱向的、水平的、複雜的和退化的撕裂。它們是最常見的關節內膝關節損傷和最常見的矯形外科手術的原因，是膝關節骨關節炎（OA）發展的一個重要風險因素。雖然創傷性撕裂可以在任何年齡（甚至是在兒童身上）發生，但50-60歲的患者更容易受到退化性的半月板撕裂的影響。創傷性撕裂對重建手術的選擇有更好的預後。縱向和水平撕裂是可以修復的，而有癥狀的創傷性放射狀撕裂通常是通過部分半月板切除術來治療的。值得注意的是，半月板切除的程度與關節內應力分布的變化以及OA發展的程度有關。與側半月板相比，內側半月板損傷更為常見，這可能是因為它的移動程度較低。然而，側半月板撕裂比內側半月板撕裂更頻繁，其臨床結果更不佳，包括OA發育和快速軟骨溶解。半月板的根部撕裂破壞了提供箍強度的環形纖維，半月板的生物力學特性改變是一種重要的臨床結果。重要的是，最近的研究表明，半月擠壓可能與進行性軟骨損傷和加速OA密切相關。

此外，半月板囊腫可能發生在外側和內側。這些通常與水平的半月板撕裂有關，並導致半月板內的空隙。對於所有類型的半月板損傷，需要量身定做的基於組織工程學的方法來增強半月板的癒合。

可能影響半月板修復的一個重要因素是關節內的炎症環境。炎症細胞因子，如白介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子α（TNF-α），在受傷或膝關節OA後有升高。重要的是，這些細胞因子能增加組織的退化，增加基質金屬蛋白酶（MMP）活性，硫酸鹽糖胺聚糖（S-GAG）釋放，以及一氧化氮和前列腺素2等促炎症介質的存在。這些細胞因子也被證明能在體外抑制整合的半月板修復，通過減少細胞積累和組織形成在半月板修復介面中，最終損害修復的抗剪強度。IL-1急性暴露在1-3天，抑制半月板修復至少28天的時間，這表明在關節損傷後的最初炎症環境可能具有長期的退化效應。此外，IL-1和TNF-α激活了半月板和其他導致關節變性的關節組織的其他退化和促炎症途徑。

自然修復和目前的手術選擇

在進行關節鏡部分半月板切除術時，目前的方法是儘可能保留儘可能多的半月板組織，因為全半月板切除術將不可避免地導致長期的骨關節炎變性。部分半月切除通常與較小程度的OA發育有關，儘管有時可能會以一種快速的方式發生。對半月板的解剖和功能的了解增加，導致了複雜的半月板修復和重建技術的發展，以保護或恢復半月板功能。為本綜述的目的，我們指的是半月板撕裂部分被放回並保持在一個位置，當半月板缺失部分或整個半月板被同種異體移植或半月板取代時，請參照半月板重建。

由於血管化和血液供應的差異，半月板的邊緣部分撕裂可能會通過各種縫合手術程序成功地修復。在中心無血管區的癒合能力較差，可通過關節鏡部分半月板切除術治療。半月板重建是基於異體移植和替代物的使用。使用半月形同種異體骨移植是一種治療性的選擇，特別是對於那些患有脛股關節疼痛的年輕患者，以及在正常排列的、穩定的關節處，沒有嚴重的關節軟骨變性改變的情況。

在中短期內，異體移植可以改善疼痛和功能。通過實驗證明，半月板切除術是一種克服異體移植的問題，並促進修復節段性的半月板缺陷，例如，部分半月板切除術。這些替代設備包括多孔牛型、膠原蛋白/GAG基質或聚氨酯。最近，人造生物材料在修復半月板切除術後，已經取得了初步的成功。

改善半月板修復的策略

半月板組織的保存對於長期的關節功能是至關重要的，因此在治療半月板缺陷方面具有決定性的指導原則。雖然目前還沒有確定的標準，但在壓力和壓縮方面的剛度測試通常被用來評估修復組織與本體組織的機械性能的相似性。其他的結果可能包括：半月板附件的強度、載入到故障的周期（疲勞）、沉降和摩擦特性。當不能實現半月性修復策略的機械完整性時，需要採用實驗性的方法來替代或再生半月組織。這些可能包括細胞或組織的管理、候選因子或基因轉移載體和/或生物相容性材料。

圖 2 基於基因、細胞和組織工程的方法來進行半月板修復。

基因、細胞和組織工程學方法對半月板修復體內包括直接管理的(病毒)基因轉移載體或體外轉基因細胞在半月板損傷,和生物相容性和生物活性材料的植入支架的形式,提供一個因子,重組基因轉移載體或體外轉基因細胞可以提供治療因素的雙重角色,重新繁衍病變。

目標細胞和組織

不同的細胞或組織可能會被用於改善半月板修復的方法：

  1. 孤立的半月板細胞，可以重新填充受傷的半月板，或加強對裂口的綜合修復，
  2. 整個半月板組織，或
  3. 祖細胞可能被誘導形成一種類似於纖維軟骨細胞的表型，其中最被研究的是來自骨髓的間質幹細胞（MSCs）、脂肪組織、滑膜、骨膜、小梁骨、臍帶血、羊水、臍帶膠質，或骨骼肌肉;同樣值得注意的是，胚胎幹細胞（ESCs）和誘導多能幹細胞（iPSCs）最近成為了幹細胞再生醫學的焦點。

可能因素

已經確定的各種因素有治療潛力，可以通過以下方式加強半月板修復：

  1. 激活細胞增殖和存活：鉑源生長因子（PDGF），基本成纖維細胞生長因子（FGF-2），胰島素樣生長因子I（IGF-I），轉化生長因子β（TGF-β）
  2. 調節細胞遷移：TGF-β，基質細胞衍生因子1（SDF-1）
  3. 刺激合成代謝途徑：PDGF、TGF-β、骨形態蛋白7（BMP-7）、肝細胞生長因子（HGF）、FGF-2、IGF-I
  4. 抑制炎症和分解代謝途徑：IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra），TNF抗體，MMPs抑製劑，TGF-βTGF-β
  5. 激活生物力學信號通路，這些途徑是合成代謝或反分解代謝的，
  6. 這類方法的組合：PDGF/HGF

將重組因子直接應用於半月板損害通常會因其短暫的藥物半衰期而受到阻礙，強調必須使用基因傳遞程序和/或含有此類因素的生物材料來改善治療，以支持持續的治療活動。

基因轉移載體

不同種類的基因載體（非病毒和病毒載體）目前可用於基因改造相關的靶細胞和組織，具有特定的優點和局限性。

非病毒載體

非病毒載體是安全的基因載體，因為它們避免了獲取病毒載體固有的複製能力。這些載體可以反覆地進行應用，但是它們的轉基因表達相對較低和短期（在半月板細胞中10-38%的轉染效率，祖細胞的14%-25%）

腺病毒載體

腺病毒載體允許在體外培養高轉導率和轉基因表達水平（在半月板和祖細胞中80%-100%的效率），但它們在體內具有免疫性，並促進非常短期的功效（最多1-2周）。

慢病毒載體

逆轉錄病毒載體可以通過整合到宿主細胞基因組中來長期維持它們的轉基因。然而，這種整合可能導致插入突變和腫瘤基因激活。這些載體只能產生分裂細胞，而且效率相對較低，在細胞選擇之前，效率為20%-30%，在選擇時達到90%。

慢病毒載體比其他病毒方法具有一定的優勢，因為它們可以整合到非分裂細胞的基因組中，並顯示出高水平的轉導功效（在祖細胞中高達90%），但它們對插入突變的可能性仍然存在。

單純皰疹病毒（HSV）載體

HSV是一種大型的載體，可以在幾乎所有已知的細胞類型中提供長轉基因，包括非分裂細胞（半月板細胞的70%轉導效率）。然而，這些載體是相對有毒的並且只提供短暫的轉基因表達。

重組腺相關病毒（rAAV）載體

rAAV載體是由複製缺陷的人類細小病毒衍生而來的。這些載體比腺病毒載體更少的免疫原性，比非病毒和逆轉錄病毒載體更有效，用於分裂和非分裂細胞的轉導（在半月板細胞中高達80%的轉導效率，在祖細胞中高達90%），允許長時間的轉基因表達。rAAV在宿主中被維持為穩定的，附體結構，同時允許通過密集的ECM在原位進行基因轉移，因為它們的體積小（20nm）。值得注意的是，使用轉接頭rAAV系統可以提高載體的大小容量。由於所有這些原因，rAAV已經成為臨床應用的首選載體。

生物相容性材料

在使用非細胞或細胞種子基質的基礎上，出現了大量的組織工程物質來取代半月板組織。

幾種治療半月性缺陷的方法主要是用非細胞基質代替半月板，避免與移植人類同種異體移植物相關的風險，如高失敗率或免疫反應和疾病傳播。不同類型的半月板替代品，如自體組織、脫細胞同種、異體移植物、膠原蛋白移植物、永久性合成支架、絲素蛋白支架，以及基於小腸黏膜下層的可生物降解支架、聚乳酸（PLA）或聚羥基乙酸（PGA），已被用於實驗和臨床研究。

但在將非細胞性的半月性結構移植到缺陷處後，移植體由滑膜纖維母細胞填充，導致瘢痕組織，生物力學性能較差。因此一些組織工程方法關注於移植前的額外的細胞播種技術。

半月板細胞、關節軟骨細胞、滑膜成纖維細胞和MSCs已在各種基質進行體外和體外細胞培養。此外，不同的環境因素，如生長因子，已被用於優化體外細胞增殖。

值得注意的是，不同的生物材料已經在體外、原位和活體實驗環境中進行了測試，這些材料與使用細胞和基因的方法相結合，包括海藻酸鹽，I型膠原蛋白溶液或I型膠原蛋白/GAG基質以及PGA支架。

策略

基因療法可以直接應用，也可以結合各種細胞或組織工程的方法來進行半月板修復，如：

  1. 直接注入基因轉移載體，
  2. 加入基因改造的細胞，
  3. 植入一種能提供重組因子的生物相容性材料，
  4. 應用自體鉑類血漿或纖維蛋白凝塊，
  5. 提供一種生物材料，提供基因轉移載體，或
  6. 移植一種經過基因改造的細胞。

無細胞策略的侵入性較低，但在治療成分中細胞的存在可能是必要的，作為一種有效的手段來重新填充半月板病變，特別是考慮到成熟組織中有大量的纖維細胞缺失。

體外基因轉移的證據

上面提到的所有基因轉移載體已經成功地應用於大多數與體外修復相關的細胞，包括半月形的纖維軟骨細胞和各種類型的祖細胞，並在體外提供不同的基因轉移效率：

  1. 非病毒載體：在半月板細胞（超過一周）中，有9-38%的效率和14%-25%的祖細胞（骨髓、軟骨、臍帶血）（在2至14天之間），
  2. 腺病毒載體：在半月板細胞內（少於一周），
  3. 逆轉錄病毒載體：在選擇半月板細胞時，可高達90%，
  4. 慢病毒載體：10%-90%的祖細胞（骨髓，iPSCs）取決於細胞來源和時間點的評估(2-15天),
  5. HSV載體：在半月板細胞中70%（少於一周），
  6. rAAV載體：80%的半月板細胞（僅檢測2天），在祖細胞（骨髓）中高達90%（21天）。

下面描述的各種途徑都是通過治療性基因傳遞方法來提高細胞類型的修復能力的。在無病毒、腺病毒和rAAV載體的情況下，通過IGF-I、FGF-2和TGF-β的基因轉移，在不存在或在一種I型膠原/GAG基質的情況下，對半月板和祖細胞（骨髓）的增殖活動進行了刺激。

在不使用生物材料的IGF-I或TGF-β基因轉移或使用腺病毒、逆轉錄病毒和rAAV載體的情況下，在不使用生物材料或使用I型膠原蛋白/GAG基質的情況下，已在半月板形細胞和祖細胞（骨髓）中成功激活合成代謝過程。一種增強半月板修復的潛在治療方法可能是通過直接的蛋白質傳遞或基因治療方法來控制促炎介質。到目前為止，還沒有報告不同候選基因的成功聯合傳遞，但這可能是在關節軟骨細胞中得到證實的。

在原位和體內進行基因轉移的證據

原位基因轉移

通過間接（細胞）和直接（無細胞）實驗程序對不同的基因轉移載體進行了測試，包括：

  1. 非病毒載體：在受傷的半月板移植體中移植的半月板細胞的轉染效率（8天），
  2. 腺病毒載體：在受傷的半月板細胞移植中，使用一種I型膠原/GAG基質（21天）移植到受傷的半月板細胞（骨髓）中80%，在完整的半月板移植中直接注射40%（幾周），
  3. 逆轉錄病毒載體：用一種I型膠原蛋白溶液（幾周），在完整的半月板移植中移植30%的半月板細胞，
  4. rAAV載體：在完整或受傷的半月移植（15天）中直接注射70%-75%。

原位基因移植治療一直試圖通過移植TGF-β rAAV載體修飾的半月板和祖細胞(MSC)或是使用腺病毒載體I型膠原/GAH矩陣在受傷的牛半月板移植組織或直接在人類病變半月板注入rAAV FGF-2和TGF-β載體，增強的修復治療~ 15至21天。

體內轉基因

在體內，大多數的基因轉移載體也被間接和直接的方法應用於半月板或修復半月板損傷，例如：

  1. 非病毒載體：採用海藻酸鹽移植的半月細胞病變中，22%的轉染效率（2天），
  2. 腺病毒載體：通過直接注射在半月形病變，40%（幾周），
  3. 逆轉錄病毒載體：用一種I型膠原蛋白溶液（幾周）或50%的半月板移植（幾周）移植到半月板病變中，20%
  4. rAAV載體：50%直接注射於半月板病變（至少20天）。

治療基因轉移在體內細胞移植已經由HGF腺病毒載體修飾半月板細胞用PGA支架在無胸腺的裸鼠模型上完成，在山羊半月板損傷中IGF-I非病毒載體修飾的祖細胞（MSCs）的用海藻酸主要增強修復病變治療16周。

然而還需要更多的信息來說明不同方法可能產生的有害影響，特別是未來應用時當病毒載體在體內被操縱要確保病人安全。

結論

基因療法單獨或結合細胞或組織工程的策略，提供了有吸引力的方法，以加強對細胞生物學、分子生物學（治療候選因素和基因）、生物材料和轉化科學的實驗研究的重大進展。

雖然有越來越多的臨床前證據顯示基因療法對治療半月性損傷的益處，以及各種已完成或正在進行的臨床治療方案，使用不同的支架、植入物或生物化合物（clinicaltrials.gov），但沒有對半月基因療法進行試驗，這是我們所知的最好的結果。在開放的問題中，最適合的候選基因和載體以及最適應的細胞源和支架必須被清晰地識別出來，因為在實驗模型中仍然相對較少的信息。此外，轉譯動物模型需要特別地反映臨床情況下不同的病變類型、病因和地點。此外，還必須考慮到，在患者協議登記之前，該組合將需要滿足監管機構的挑戰性要求。在這方面，科學家、臨床醫生、工業界和監管機構之間的聯合努力將是解決治療患者此類病變的必要條件。

主要參考文獻：Cucchiarini M, McNulty AL, Mauck RL, Setton LA,

Guilak F, Madry H. Advances in combining gene therapy with cell and tissue

engineering-based approaches to enhance healing of the meniscus. Osteoarthritis

and cartilage. 2016;24(8):1330-1339. doi:10.1016/j.joca.2016.03.018.

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